基于HPLC指紋圖譜和化學計量學評價白及飲片質量

朱環(huán)，謝秉湘，張崇生，葉鳴，張麗萍

溫州市食品藥品檢驗科學研究院，浙江 溫州 325000

白及為蘭科植物白及[Bletzlla striata （Thunb.）Reichb.f.]的干燥塊莖[1-2]，因其在咯血、外傷出血、嘔血、皮膚皸裂、美白等方面有著良好的功效[3-4]，而被廣泛應用于醫(yī)藥美容等行業(yè)。中藥臨床療效與藥材質量息息相關[5]，傳統(tǒng)中藥材“看貨評級，分檔議價”的質量評價機制[6]只注重性狀，而現(xiàn)行《中國藥典》（2015年版）僅收載了白及性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、水分、總灰分和二氧化硫這六項藥材通用的檢驗方法，缺乏直觀化、數(shù)據(jù)化的品質評價手段。為了規(guī)范白及市場，很有必要對其質量現(xiàn)狀做一個全面評價。為了避免樣品的地域局限性，本研究共收集了包括浙江、安徽、河北、湖南、江西在內(nèi)的30家飲片生產(chǎn)企業(yè)的36批次樣品，通過樣品的大量收集，借助高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，結合相似度、聚類分析和多元統(tǒng)計分析，為全面評價市售白及質量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料 Agilent 1260系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），XSE205DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多集團），DHG-9091A電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），SX2-4-10NP箱式電阻爐（上海一恒科學儀器有限公司），STEHDB-107-1二氧化硫殘留量測定儀（濟南盛泰電子科技有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司），KQ-300TDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為純水。白及經(jīng)鑒定均為蘭科植物白及的干燥塊莖。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)檢查項目的測定：按照《中國藥典》（2015年版）一部“白及”項下方法對36批次樣品的水分、總灰分、二氧化硫殘留量進行檢測。

1.2.2 指紋圖譜色譜條件：在參考文獻[7-9]和本實驗室前期工作基礎上[10]，建立白及指紋圖譜，選用Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm，進樣量20 μL，以乙腈為流動相A，0.05%磷酸水溶液為流動相B，按表1梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 指紋圖譜樣品溶液的制備：精密稱取白及中粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水50 mL，密塞，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率 40 kHz）處理60 min，放冷，再稱量，用70%甲醇水補足減失的量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.4 聚類分析與多元統(tǒng)計分析：將色譜圖信息導入ChemPattern軟件建立相似度模型并確定共有峰，再將共有峰峰面積標準化處理后分別導入SPSS21.0 和Simca-P 13.0軟件，對樣品進行系統(tǒng)聚類并建立偏最小二乘判別分析（p artial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型，其中PLSDA是有監(jiān)督模式的識別方法，先將樣品按不同的類別屬性分組，繼而建立模型進行統(tǒng)計分析，其著重強調(diào)組間差異性，削弱組內(nèi)與研究無關的隨機差異，從而更好地把握指紋圖譜多維數(shù)據(jù)整體特征和變異規(guī)律，并能有效解決樣本量少、自變量較多、相關性較高的數(shù)學模型，該方法能夠找出兩組白及之間存在顯著性差異的化學成分。

2 結果

2.1 水分、總灰分和二氧化硫殘留量測定 36批次樣品水分介于8.6%～14.0%（規(guī)定≤15.0%），總灰分介于1.4%～4.3%（規(guī)定≤5.0%），二氧化硫殘留量介于1～384 mg/kg（規(guī)定≤400 mg/kg），二氧化硫殘留量低于50 mg/kg占比為77.8%，表明白及無硫化趨勢明顯，結果均符合規(guī)定（見表2）。

2.2 指紋圖譜精密度試驗 取同一樣品溶液連續(xù)進樣6次，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（四裂紅門蘭素，即militarine）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3.0%，結果表明方法精密度良好。

2.3 指紋圖譜重復性試驗 取同一樣品6份制備樣品溶液，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（militarine）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，結果表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜穩(wěn)定性試驗 取同一樣品溶液分別于0、4、8、12、24 h進樣，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（militarine）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示6個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，結果表明方法所提取的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 36批次樣品常規(guī)檢驗結果

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的確定 將36批樣品的色譜信息導入ChemPattern 2.1軟件（36批樣品疊加圖，見圖1），所有樣品相似度均大于70%（見圖2），表明該方法建立的白及指紋圖譜穩(wěn)定可靠。再以峰面積為來源，平均數(shù)為統(tǒng)計方式，篩選占比5%以上的共有峰，采用高斯曲線模擬方法，結果顯示36批樣品存在6個共有峰（見圖3）。

2.6 聚類分析與多元統(tǒng)計分析 以各共有峰面積除以6個共有峰峰面積之和的數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)，以組間連接法結合余弦距離對36批次樣品進行聚類分析（見圖4）。結果顯示，36批樣品可聚為兩類，S4，S5，S7，S9，S16～S18，S25，S28，S29，S31～S33，S35～S36聚為一類，S1～S3，S6，S8，S10～S15，S19～S24，S26，S27，S30，S34聚為一類。

圖1 白及樣品HPLC色譜圖

圖2 白及樣品相似度評價

圖3 白及樣品共有色譜峰圖

為更好地觀察上述聚類分析結果，同時也為找出差異性的化學成分，將各共有峰峰面積除以6個共有峰峰面積之和的數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析。以白及樣品共有峰比值數(shù)據(jù)設定分類變量為Y，樣品編號按聚類分析結果分為兩組：S4，S5，S7，S9，S16～S18，S25，S28，S29，S31～S33，S35～S36為第一組，S1～S3，S6，S8，S10～S15，S19～S24，S26，S27，S30，S34為第二組，進行PLSDA分析。結果顯示，由聚類分析為兩大類的白及樣品能夠明顯區(qū)分開[R2X（cum）=0.63，R2Y（cum）= 0.71，Q2=0.59，均大于0.5，見圖5A]，表明所建模型穩(wěn)定且預測能力較強。從相對應的載荷圖（見圖5B）可知，3、4、5號色譜峰距原點較遠，權重值較大，因此，它們所對應的化學成分對兩組的區(qū)分貢獻較大。由圖5C可知變量5（色譜峰）自變量投影重要性指標（variable imp ortance in p rojection，VIP）值大于1，這表明該色譜峰所代表的化學成分對兩組的區(qū)分貢獻較大，為差異標志物。

圖4 36批白及樣品的聚類分析結果

圖5 36批白及樣品的多元統(tǒng)計分析結果

3 討論

目前，針對白及質量評價以含量測定[11-14]為主。然而，中藥材成分復雜，而且白及作為一種廣域生長的作物遍布全國，僅以個別含量的高低難以對其作出全面評價。指紋圖譜能夠從整體上表現(xiàn)出中藥的內(nèi)在質量狀況[15-17]，借助多元統(tǒng)計分析更能直觀、全面地評價其內(nèi)在品質[18-19]。如今，此類結合式的綜合評價方法得到了學術界認可，如徐鋒等[20]通過聚類分析和主成分分析評價地瓜藤的質量，林秀敏等[21]建立指紋圖譜并借助化學計量法對白芍進行綜合分析，曹斯瓊等[22]基于主成分分析及聚類分析評價王不留行質量，張曉男等[23]通過多元統(tǒng)計分析評價炮制前后桃仁的質量等。因此，為了更有效地控制白及的質量，保證各市售樣品質量的穩(wěn)定性，本項目通過指紋圖譜，結合多元統(tǒng)計分析方法，比較了36批次樣品的質量現(xiàn)狀，篩選出造成白及質量差異的主要化學成分，為規(guī)范白及的種植與炮制工藝提供參考依據(jù)。

此次監(jiān)督抽樣檢驗發(fā)現(xiàn)各廠家的白及樣品按 《中國藥典》（2015年版）檢驗全部合格，并且無硫化趨勢明顯，表明飲片企業(yè)對藥材質量的良好把控和藥材市場的日益規(guī)范。為了更深一步了解白及的內(nèi)在質量狀況，我們通過指紋圖譜結合多元統(tǒng)計分析對其進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)36批白及樣品的相似度均大于70%，存在6個共有峰，聚類分析和PLS-DA結果一致，顯示樣品能夠分成兩大類，提示市場上白及存在質量和臨床效果不一致的可能性，這可能與不同生長環(huán)境以及不同栽培方式化學成分積累的差異有關。這些結果可為白及的質量控制提供參考依據(jù)。