甲狀腺乳頭狀癌中PBX3和Twist表達的臨床意義

曹學全，蔡小波，楊朝暉，魏科娜，阮正英，周璐青，盧洪勝

臺州市中心醫(yī)院（臺州學院附屬醫(yī)院） 病理科，浙江 臺州 318000

甲狀腺乳頭狀癌（papllary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的亞型，約占全部甲狀腺癌的80%。大多數PTC甚至在發(fā)生淋巴結轉移的情況下仍具有相對較高的生存率[1]。然而15%的淋巴結轉移病例具有侵襲性行為，其特征表現為局部浸潤、遠處轉移、治療耐藥性以及復發(fā)率和病死率增加[2]。因此，研究PTC侵襲、轉移的分子機制，發(fā)現有效的治療靶點具有重要的臨床意義。前B細胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia homeobox 3，PBX3）是PBX家族中一個主要的輔因子，它能提高同源盒蛋白的DNA結合/轉錄活性，其異常高表達是誘導和維持耐藥急性髓系白血病的必要條件[3-4]。此外，體外研究發(fā)現PBX3的過度表達促進胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而減少癌細胞的凋亡[5]。Twist轉錄因子是由TWIST1基因編碼，屬于堿性螺旋環(huán)螺旋（basic helix loop helix，bHLH）轉錄因子家族成員，在細胞譜系的確定和分化中起著重要的作用。研究證實，Twist的過度表達與腫瘤的臨床病理特征和化療的耐藥有關，并可作為較短總生存期的候選生物標志物[6-7]。PBX3基因和蛋白在PTC組織中是否存在異常表達，其與臨床病理特征的關系及PBX3和Twist的相關性如何，目前仍不清楚。本研究采用RT-qPCR及免疫組化En vision二步法分別檢測PTC和相應癌旁組織中PBX3和Twist m RNA及蛋白的表達特點，擬分析PBX3和Twist基因及蛋白表達水平變化在PTC發(fā)生、侵襲和轉移中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 組織標本 選取臺州市中心醫(yī)院2017年1月至2018年1月住院進行手術切除的PTC標本60例，術后常規(guī)病理診斷結果為PTC。所有患者均具有完整的臨床病理資料，且術前未接受放療、化療及生物學治療。60例PTC患者中，男19例，女41例，年齡21～77（46.1±13.4）歲。甲狀腺癌TNM分期參照2010年第七版美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯合會（UICC）制定的分期標準：I～II期38例，III～IV期22例。同時選取同組30例PTC的相應癌旁組織（距離腫瘤≥2 cm）作為對照，經病理診斷為正常甲狀腺組織，患者男12例，女18例，年齡21～72（49.2±14.0）歲。收集癌和癌旁標本分為2份，1份在離體后20 min內放入-80 ℃低溫冰箱保存用于RT-qPCR檢測PBX3和Twist基因的表達量；1份標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組化標記PBX3和Twist蛋白的表達。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen 公司，PIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料等均購自美國Promega公司。PBX3兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Twist兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，En Vision通用試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測PBX3和Twist mRNA表達：在美國國家生物技術信息中心（NCBI）基因庫中查找目的基因PBX3、Twist和內參基因的編碼序列，選取GAPDH為內參基因，所有基因PCR引物序列均由溫州長豐生物科技公司設計合成，具體如下：PBX3正向 引物5’-CAAGTCGGAGCCAATGTG-3’，反向引物5’-ATGTA GCTCAGGGAAAAGTG-3’；Twist正向引物5’-GGAGTCCGC AGTCTTACGAG-3’，反向引物5’-TCTGGAGGACCTGGTAGA GG-3’；內參GADPH正向引物5’-CTGGGCTACACTGAGCAC C-3’，反向引物5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’，參照TRIzol試劑盒說明書提取PTC和癌旁組織的總RNA并檢測濃度及純度，然后按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，37 ℃孵育60 min。加入目的基因的上、下游引物和SYBR Green熒光染料，完成40個PCR循環(huán)，收集熒光信號進行結果分析，計算目的基因的mRNA相對表達量。

1.3.2 免疫組化檢測PBX3和Twist蛋白表達：應用免疫組化En Vision二步法進行檢測。制作4 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化。3% H2O2室溫孵育阻斷內源性過氧化物酶的活性，0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓水浴抗原修復，1%山羊血清封閉，滴加一抗（PBX3稀釋濃度為1:200，Twist為1:100）4 ℃冰箱過夜，次日滴加二抗（En Vision免疫組化檢測試劑），DAB顯色，蘇木素復染、鹽酸分化、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察表達特點和陽性定位。以PBS代替一抗作陰性對照，PBX3用前列腺癌組織作陽性對照，Twist用宮頸癌組織作為陽性對照。陽性細胞表現為淡黃色至棕褐色顆粒，PBX3陽性表達均定位于細胞質，Twist陽性表達定位于細胞質和（或）細胞核。在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取至少5個高倍視野，每個視野計數200個細胞進行評分和記錄。每張切片根據半定量積分法進行判定，最終積分=染色強度×陽性細胞百分比。染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞占所有細胞的百分比：＜10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分，最終積分≤4分為陰性，＞4分為陽性[8]。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行數據分析。計量資料以 ±s表示，2組間基因表達水平的比較采用t檢驗，不同組間蛋白表達陽性率的比較采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關分析探討PBX3和Twist蛋白表達的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBX3、Twist mRNA表達情況

2.1.1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist mRNA表達的比較：PTC組織中PBX3、Twist m RNA的表達量均高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.1.2 PBX3、Twist mRNA的表達與PTC臨床病理特征的關系：PBX3、Twist mRNA表達均與PTC的包膜侵犯、淋巴結轉移及臨床分期有關（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤直徑和組織學分型均無關（P＞0.05）。見表1。

圖1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist mRNA相對表達量

2.2 PBX3、Twist蛋白表達情況

2.2.1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist蛋白表達的比較：多數PTC中PBX3在細胞質和Twist在細胞質和（或）細胞核呈彌漫強表達，而在癌旁組織中多為表達缺失或少數弱或中等強度表達。PTC組織中PBX3和Twist蛋白的陽性表達率分別為73.33%（44/60） 和68.33%（41/60），癌旁組織中PBX3和Twist蛋白的陽性表達率分別為16.67%（5/30）和13.33%（4/30），癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織（P＜0.05），見圖2。

2.2.2 PBX3、Twist蛋白表達與PTC臨床病理特征的關系：伴有包膜侵犯、淋巴結發(fā)生轉移和III～IV期PTC組織中PBX3蛋白表達均高于無包膜侵犯、無淋巴結轉移及I～II期PTC組織（P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織學分型中的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。包膜是否侵犯、淋巴結是否轉移及I～II期和III～IV期PTC組織中Twist蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織學分型中的表達略有差異，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2.3 PBX3和Twist蛋白表達在PTC中的相關性： Spearman等級相關分析結果顯示，PBX3和Twist蛋白表達共同陽性者35例，二者表達共同陰性者10例，PTC組織中PBX3和Twist蛋白陽性表達呈顯著正相關（r=0.400，P=0.002）。

3 討論

PBX3是PBX家族中的一個重要的轉錄因子，具有高度保守的同源結構域。早期的研究證實，PBX3最顯著的作用是維持胚胎干細胞的未分化狀態(tài)，在人類心臟發(fā)育和先天性心臟病中有潛在的作用[9]。近年來研究發(fā)現，PBX3與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，其在胃癌、前列腺癌等多種實體腫瘤及白血病中表達明顯升高，PBX3表達增加與腫瘤的生長、侵襲、轉移和增殖有關[10-11]。研究表明，PBX3在多種惡性腫瘤中存在高表達，且與腫瘤的侵襲、轉移及預后有關[12]。本研究從基因和蛋白水平探討PTC和相應癌旁組織中PBX3和Twist的表達水平及PTC患者不同臨床病理特征與兩者表達的關系。熒光定量PCR結果顯示，PBX3 mRNA在PTC組織中的表達均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。免疫組化結果顯示，PBX3蛋白在多數PTC中呈彌漫強表達，而在癌旁正常組織中呈弱表達或不表達，且癌組織中PBX3蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。表明PTC中PBX3基因和蛋白表達變化一致，提示PBX3基因和蛋白表達水平升高可能與PTC的發(fā)生密切相關，在病理診斷中增加PBX3基因和蛋白表達的檢測有助于PTC良性病變的鑒別。進一步統計學分析發(fā)現，伴有包膜侵犯、淋巴結出現轉移和III～IV期PTC組織中PBX3 m RNA和蛋白表達均高于無包膜侵犯、無淋巴結轉移及I～II期PTC組織（P＜0.05）。這表明隨著PBX3基因和蛋白水平升高，PTC的惡性程度和臨床分期越高，越容易侵犯甲狀腺包膜和淋巴結，PBX3可能參與PTC細胞的侵襲、轉移，在PTC的發(fā)生、進展過程中發(fā)揮作用。該結果與LI等[12]在宮頸癌中的研究結果一致。

表1 PBX3和Twist m RNA表達與PTC臨床病理特征的關系

圖2 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist蛋白表達（En Vision染色，×400）

Twist是高度保守的bHLH轉錄因子家族成員之一，其特征在于靶向共有E-box序列5’-CANNTG-3’和 HLH區(qū)的堿性DNA結合區(qū)[13]。生理情況下，Twist是胚胎發(fā)育過程中，特別是中胚層的形成、發(fā)育和分化過程中的重要調控因子。病理情況下，隨著Twist在腫瘤作用中的研究深入，發(fā)現Twist是一種癌基因，通過誘導上皮間質轉化參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移和耐藥[14-15]。本研究發(fā)現，Twist mRNA及蛋白在PTC組織中的表達均明顯高于癌旁組織 （P＜0.05），與SUN等[16]在胃食管交界處腺癌及近端胃癌中Twist高表達的研究結果一致。Twist在PTC和癌組織和癌旁組織中的表達差異在腫瘤診斷及鑒別診斷中提供了新的思路。國內學者進一步證實，Twist診斷PTC在敏感度、特異度和準確性方面顯著高于良性對照組織，推測Twist可用于甲狀腺良惡性腫瘤的鑒別[17]。本研究免疫組化結果還發(fā)現，Twist陽性表達定位于細胞質和（或）細胞核，在30%的PTC組織中存在細胞質和細胞核同時表達，可能與分子進入細胞核及其介導激活的調控機制有關。分析Twist表達與PTC臨床病理特征的結果發(fā)現，與無包膜侵犯、無淋巴結轉移及I～II期PTC組織比較，Twist m RNA和蛋白表達在發(fā)生包膜侵犯、淋巴結出現轉移及III～IV期PTC組織中進一步升高（P＜0.05）。提示Twist基因和蛋白表達水平增高可能在在PTC的發(fā)生中起促進作用，且與包膜侵犯、淋巴結出現轉移和臨床分期晚期密切相關，檢測Twist基因和蛋白表達水平有助于臨床評估PTC的進展情況。

表2 PBX3、Twist蛋白表達與PTC臨床病理特征的關系

研究表明，PBX3和Twist過表達均可誘導上皮間質轉化的發(fā)生，從而促進腫瘤細胞的侵襲、轉 移[10，14]。有關PBX3和Twist在PTC中關系的研究鮮見文獻報道，本研究對PTC中PBX3和Twist表達的相關性采用Spearman等級相關分析，發(fā)現PBX3過表達，Twist表達增加，二者的表達呈正相關，其異常高表達與PTC的發(fā)生、侵襲和轉移密切相關，表明PBX3和Twist的表達變化可能在PTC的進展中起協同調控作用。聯合檢測PBX3和Twist在PTC中的表達水平，對預測PTC的侵襲、轉移能力及預后有一定的臨床價值。對于PBX3和Twist在PTC中調控的具體機制需要下一步進行體內、體外實驗探究其生物學功能及分子機制。