神經系統SARM1條件性敲除小鼠的構建及其應用

項魯丹，孫煥坤，吳仟，汪偉，黃智慧，于欣

1.溫州醫科大學 精神醫學學院，浙江 溫州 325035；2.杭州師范大學 藥學院，浙江 杭州 311121

SARM1（sterile alpha and TIR motif containing 1）蛋白是TLR（Toll-like receptor）5個接頭蛋白中的一個[1-2]，由MINK等[3]于2001年首次報道。SARM1蛋白高表達于神經元[4]，在中樞神經系統中發揮著重要作用，是軸突變性的關鍵因 子[5]，既參與腦內的先天免疫[4]，又調控神經元形態[6]和凋亡[7]。除此之外，SARM1亦影響神經元的突觸反應和突觸后蛋白表達水平[8]。因此，SARM1與神經系統的發育和功能密切相關。

然而既往對于SARM1基因功能的研究均是在RNA干擾（RNAi）或者全身性敲除SARM1基因的基礎上完成的。RNAi和全身性敲除不能特異性地在特定細胞中將基因敲除，大大限制了相關基因蛋白在某些特定細胞中作用的研究。為了更精確地研究SARM1在神經細胞中的作用，本研究采用了ES細胞 （embryonic stem cell）打靶方式構建了SARM1基因條件性敲除（conditional knockout，CKO）小鼠，并將其與神經系統特異性的Nestin-Cre小鼠雜交，最終得到SARM1Nestin-CKO小鼠，并探討SARM1在神經精神系統疾病中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SARM1flox/flox小鼠（20～25 g，6～ 8周齡，雌性）和Nestin-Cre工具鼠（20～25 g，6～8周齡，雄性）均由上海南方模式生物科技股份有限公司制備。動物飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009，本研究獲得溫州醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物與試劑：PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑混合物購自美國Sigma公司。脫脂奶粉購自美國BD公司。1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH=6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH=8.8）、30% Acrylamide均購自北京索萊寶有限公司。多聚甲醛購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔抗SARM1（ab226930）購自美國Abcam公司，鼠抗β-actin（HC201-01）購自北京全式金生物技術有限公司，鼠抗NeuN（MAB377）購自美國Millipore公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯二抗、ECL檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測小鼠基因型：剪取小鼠尾巴加入消化液后100 ℃加熱1 h，冷卻至室溫后加入pH=8.0的Tris-HCl 10 μL輕輕吹打。吹打后置于4 ℃離心機中12 000 r/min離心20 min。取上清液進行基因型鑒定。在離心管中加入DNA、引物、PCR mix構建12 μL PCR反應體系。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min；共32 個循環，最后再延伸72 ℃ 5 min。PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。根據電泳結果篩選含有目的條帶的小鼠，判斷對應小鼠是雜合子還是純合子，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 Western blot檢測SARM1蛋白表達：在海馬、皮層、小腦組織中加入含有PMSF的蛋白裂解液RIPA，每0.1 g組織中加入2 mL裂解液。置于勻漿機中以60 Hz頻率45 s/次研磨4～5 次。在4 ℃迷你旋轉培養器中旋轉30 min，并將裂解液以12 000 r/min離心20 min。取上清液，加入5×蛋白緩沖液，并在100 ℃下煮沸10 min。通過SDS-PAGE（8%～12%）分離蛋白質，然后將其轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后將 Western blot與一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗包括兔抗SARM1（1:2 000）、β-actin（1:10 000）。隨后，將膜在TBST中洗滌3次，并與HRP偶聯的二抗孵育 1 h。在TBST中再洗滌3次后，使用ECL檢測試劑盒檢測蛋白質信號。使用Quantity One軟件分析印 跡。

1.2.3 免疫熒光評估SARM1在腦組織中表達：心臟灌注后，取出小鼠的腦組織并用新鮮的4%多聚甲醛固定，用30%蔗糖脫水2～3 d，并在冷凍切片機上切成20 μm的切片。在5% BSA和0.3% Triton X-100中，在室溫下封閉1 h進行免疫熒光染色，在4 ℃下與一抗孵育過夜，在PBS中洗滌3次，然后在室溫下孵育二抗1 h。一抗包括兔抗SARM1（1:200），小鼠抗NeuN（1:200）。通過熒光顯微鏡（日本NIKON公司）對圖像進行可視化，并由Image J或Adobe Photoshop CC 14.0軟件進行處理，圖像的定量分析由Image J完成的。

1.2.4 小鼠體質量和腦組織大小觀察：分別在出生后7、14、21、28、35、42 d記錄實驗組和對照組小鼠的體質量，并進行階段性取材拍照。在出生后14、30、60 d進行腦組織大小測量。

1.2.5 小鼠行為學檢測：對小鼠進行曠場實驗和高架迷宮實驗，觀察小鼠在新異環境中的自主行為、探究行為與緊張度[9]。曠場實驗：實驗在安靜的環境下進行。將動物放入箱內底面中心，記錄 5 min之內小鼠的總路程和在中央所占的時間百分比。實驗結束后進行箱子內壁及底面的清洗，以免上次動物余留的信息（如動物的大小便、氣味）影響下次測試結果。更換動物，繼續實驗。高架十字迷宮實驗：將動物放入迷宮中央區，并且每只動物都需要放在同一個方向同一個位置，記錄5 min內實驗動物開臂和閉臂的進入次數及進入各臂的時間。 10 min后將動物放回籠內。同時清理迷宮，繼續實驗。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS22.0軟件對數據進行統計學分析。所有數據代表至少3個獨立實驗的結果。計量資料以表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SARM1在腦組織中的表達情況 為明確SARM1在各個腦區的表達量，取小鼠大腦皮層、海馬、小腦、紋狀體、丘腦等腦區的組織進行Western blot檢測，發現SARM1在小鼠各個腦區均有表達（見圖1A）。其中，在皮層表達量較高，海馬、小腦、丘腦表達量稍低于皮層，在紋狀體中表達量較低（見圖1B）。進一步采用SARM1和神經元特異性標記物NeuN免疫雙標熒光染色方法發現SARM1蛋白主要在神經元中高表達（見圖1C）。這些結果表明SARM1在大腦各個腦區均有表達，主要高表達于神經元。

圖1 SARM1蛋白在小鼠腦中的表達情況

2.2SARM1Nestin-CKO小鼠培育 為進一步研究SARM1在神經元中功能，我們構建了神經系統條件性敲除SARM1的小鼠。該小鼠主要通過Infusion的方法構建ES細胞打靶載體，該載體經線性化后，電轉染C57BL/6J×129S3 ES細胞。陽性ES細胞克隆經擴增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠。高比例嵌合小鼠與Flp小鼠交配獲得6 只去Neo陽性F1代小鼠。將去Neo陽性F1代小鼠與野生型C57BL/6J小鼠進行繁育，得到F2代去Flp小鼠（見圖2A）。由于SARM1蛋白主要表達于中樞神經系統，在神經元中高表達。為了進一步研究SARM1在中樞神經系統以及神經細胞中的作用，我們采用了在神經細胞中特異性表達Cre的Nestin-Cre轉基因工具鼠。F2代鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，產生F3代鼠（見圖2B）。將F2、F3以及后代鼠剪尾提取DNA后，采用PCR擴增的方法檢測Flox片段以及Cre重組酶的表達情況（見圖3）。該Flox小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，其后代Flox純合、Cre陽性小鼠的Flox區域被敲除，導致目的基因在特定組織和細胞類型中功能性缺失。

圖2 構建SARM1Nestin-CKO小鼠示意圖

2.3SARM1Nestin-CKO小鼠鑒定 將后代鼠剪尾提取DNA后PCR擴增檢測Flox片段以及Cre重組酶的表達。不含Flox片段的小鼠可見1條466 bp條帶，Flox純合子只有1條500 bp條帶，雜合子有466 bp和500 bp 2個條帶（見圖3A）。表達Nestin-Cre重組酶的鼠在150 bp處可見條帶（見圖3B），成功構建出SARM1基因在神經和膠質前體細胞中特異性敲除鼠與其對照鼠。Western blot檢測結果表明，與對照小鼠相比，SARM1Nestin-CKO小鼠3個腦區的SARM1蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3C-D。上述這些結果從DNA水平以及蛋白水平上驗證了SARM1Nestin-CKO小鼠構建成功。

圖3 SARM1Nestin-CKO小鼠的鑒定

2.4SARM1基因條件性敲除對小鼠生長發育的影響 為明確SARM1基因條件性敲除是否會影響小鼠的生長發育，分別在出生后7、14、21、28、35、42 d記錄實驗組和對照組雄性小鼠的體質量。在相同性別情況下，SARM1Nestin-CKO小鼠與對照小鼠在體質量與形態上無差異（見圖4）。在神經系統，SARM1敲除小鼠與對照小鼠的腦組織大小在出生后14、30、60 d差異無統計學意義（P＞0.05），并且在神經元數量上，皮層和海馬區差異也無統計學意義（P＞0.05），見圖5。這些結果表明SARM1基因條件性敲除不影響小鼠的生長發育。

2.5SARM1Nestin-CKO小鼠不存在明顯的焦慮障礙 曠場實驗和高架十字迷宮實驗結果表明，2組小鼠自主活動的總路程和在中央所占的時間百分比，以及進入開臂的次數和時間差異均無統計學意義（P＞ 0.05），不存在焦慮樣行為（見圖6）。

圖4 SARM1Nestin-CKO小鼠生長發育情況

圖5 野生型和SARM1Nestin-CKO小鼠神經發育結果

圖6 野生型和SARM1Nestin-CKO小鼠曠場和高架十字迷宮實驗結果

3 討論

神經精神疾病越來越受到人們關注，基礎及臨床研究發現神經精神疾?。òò柎暮Ｄ?、抑郁癥、自閉癥等）的發生都與免疫系統的功能調節相關。免疫調節蛋白在神經系統的發育及功能調節中所起到的作用及其機制成為學界研究的熱點。而SARM1蛋白作為先天免疫中重要的負性調節蛋白[10]， 也受到研究者的關注。我們成功構建了SARM1基因在神經細胞中特異性敲除的CKO小鼠，對于未來的研究可能提供了非常有價值的研究工具。

本研究首先證實了SARM1蛋白在中樞神經系統具有很高的表達量，尤其是在神經細胞中的表達，這和之前的研究[4]發現是一致的。這一事實間接暗示了SARM1蛋白在神經元中可能發揮著重要的生理作用。以往的研究顯示，生理狀態下SARM1通過至少兩種途徑調節神經元的形態發生。SARM1一方面可通過參與細胞中的微管穩定來調節樹突和軸突的生長；另一方面，通過MKK-JNK途徑調節神經元樹突分支化，軸突生長和神經元極性的建立[10]。另外，SARM1的敲低還會改變腦內炎癥因子的表達水平，在SARM1基因敲除的胚胎腦中，IL-6和IFN-β均被上調[11]，表明SARM1可能對胚胎神經元的先天免疫反應產生負調節作用，然而SARM1對于神經系統發育的影響尚未可知。而更為令人感興趣的是，人類SARM1基因位于染色體17q11（17：26 698 987-26 728 065），該染色體位于自閉癥易感性基因座6（Auts6，OMIM% 609378，17：24 000 000-31 800 000）中。其次，自閉癥患者的額皮質中SARM1蛋白水平降低[8]。最后，SARM1基因敲除小鼠的行為分析還顯示出智力殘疾，社交行為受損和認知僵化[11]，這些行為缺陷類似于自閉癥患者的特征。由此，盡管我們在初步的行為學測試如曠場實驗和高架迷宮中沒有看到顯著的表型，但在未來的研究計劃中我們將對SARM1條件敲除小鼠的學習記憶、社交行為、對抑郁模型的敏感性等行為表現進行深入地探索。另一方面，我們已經知道，當軸突發生損傷后，SARM1蛋白的多個TIR結構域進行關聯，啟動下游信號[12-13]， TIR二聚體的形成觸發了NAD+的快速分解[5]，從而導致軸突中ATP的消耗和軸突中瓦勒變性的發生[14]。 由此我們猜測SARM1的缺失可能會帶來一定程度的神經保護作用，因此SARM1基因的條件敲除對于神經退行性疾病比如阿爾茨海默病、脊髓側索硬化癥、多發性硬化癥以及神經損傷性疾病如腦缺血、脊髓損傷等都有可能產生保護作用，從而為此類疾病的治療提供潛在的藥物靶點。

總而言之，盡管我們在最初的探索中并沒有得到非常顯著的表型，但我們有理由相信敲除小鼠的培育可能為研究SARM1在多種精神神經疾病中的作用提供一個有效的工具。