循環(huán)游離DNA水平監(jiān)測對乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后評估的臨床價值

楊兆利 白紅英 閆道杰

慢性乙型肝炎患者可因肝臟反復(fù)損傷、纖維化進而發(fā)展為乙型肝炎肝硬化，常伴隨門靜脈高壓等多種并發(fā)癥，甚至合并肝癌。循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)是細胞凋亡和(或)組織損傷的標志物，通常由受損的組織細胞、炎癥細胞等釋放，其在血液循環(huán)中的表達水平可反映組織細胞的損傷程度。目前已發(fā)現(xiàn),cfDNA與癌癥、創(chuàng)傷、膿毒癥、心肌梗死等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，有研究[1-2]認為cfDNA具有一定的預(yù)后預(yù)測能力，但其對乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后評估作用，尚少見文獻報道。本研究擬觀察血清乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)cfDNA水平變化在乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后評估中的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年7月—2015年7月在濟南市人民醫(yī)院診治的乙型肝炎肝硬化失代償期患者112例，其中，男78例、女34例;年齡為(51.1±9.8)歲,病程5～20年。Child-Pugh A級39例，年齡為(51.3±8.7)歲；B級31例，年齡為(50.1±10.8)歲；C級42例，年齡為(52.4±7.4)歲。納入標準:符合《病毒性肝炎防治方案》[3]中的失代償期肝硬化診斷標準；初始應(yīng)用阿德福韋酯+拉米夫定或替比夫定+阿德福韋酯抗病毒治療；無自身免疫性肝炎；預(yù)計生存期>1年；無其他嚴重的器質(zhì)性疾病。排除標準：①臨床資料不全；②伴有嚴重心血管和呼吸系統(tǒng)疾病；③合并惡性腫瘤；④行脾切除術(shù)或經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門腔分流術(shù)等手術(shù)；⑤合并原發(fā)性腎臟疾病；⑥因血液系統(tǒng)疾病和非肝病原因死亡；⑦因巴德-吉亞利綜合征、門靜脈畸形等引起的食管靜脈曲張破裂出血者。選擇同期年齡、性別相匹配的32例門診健康體檢者作為對照組，其中男21例、女11例，年齡為(51.4±10.9)歲。112例患者與32例健康體檢者性別和年齡的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核和批準(批準號為2014lw-2)，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 分組比較cfDNA的差異 根據(jù)Child-Pugh分級標準將112例患者分為Child-Pugh A級組、Child-Pugh B級組和Child-Pugh C級組；根據(jù)是否出現(xiàn)上消化道出血分為出血組(48例)和未出血組(64例)；根據(jù)肝靜脈壓力梯度(hepatic venous pressure gradient,HVPG)分為高HVPG組(>20 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa,50例)、中HVPG組(15～20 mmHg，29例)和低HVPG組(10～<15 mmHg，33例)。比較對照組與各病例組間血清cfDNA的差異。

1.3 血清cfDNA的定量檢測 取5 μL血清樣品，用雙蒸水稀釋至100 mL。用Tris-EDTA(TE)緩沖液(上海生工生物工程有限公司)稀釋人基因組DNA標準溶液(北京孚博生物科技有限公司)至0、 50、 100、 200和400 μg/L質(zhì)量濃度。將測試樣品和標準品稀釋并置于95 ℃的坩堝中加熱5 min使DNA解鏈，隨即將其快速置于冰上以維持單鏈狀態(tài)。將含有50%裂解液、1 μg/L蛋白酶K(南京金斯瑞生物科技有限公司)的90 μL探針準備液和10 μL測試樣品加入到96孔板中(均檢測3個復(fù)孔)，用錫箔密封，置于55 ℃雜交箱中孵育過夜，用緩沖液洗滌96孔板3次，依次加入前擴增探針、擴增探針，以55 ℃保持1 h，共洗滌3次，然后加入標記探針，以50 ℃保持1 h，洗滌3次后，加入堿性磷酸酶底物催化劑(dioxetane,北京孚博生物科技有限公司)，用錫箔密封，在室溫下靜置5～10 min，顯影發(fā)光，應(yīng)用微孔板發(fā)光儀(美國Promega公司)檢測每個孔光子數(shù)。以標準品的濃度為橫坐標，檢測到的光子數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線，并獲得濃度與光子數(shù)相關(guān)的方程式。然后，根據(jù)等式計算每孔的cfDNA水平，×20獲得每孔稀釋前的cfDNA水平。

1.4 預(yù)后影響因素的研究 對研究對象進行電話隨訪，直至患者發(fā)生終點事件或研究結(jié)束，終點事件定義為患者死亡。分析生存組與死亡組患者入院時的合并癥、臨床模型評分和實驗室檢查結(jié)果;本研究截止日期為2019年6月30日。

2 結(jié) 果

2.1 不同分組法各組患者血清cfDNA水平及其生存情況 與對照組相比，不同Child-Pugh分級組患者血清cfDNA均顯著升高(P值均<0.05)，且B級組患者血清cfDNA顯著高于A級組(P<0.05)，C級組顯著高于B級組(P<0.05)。與對照組相比，出血組與未出血組患者血清cfDNA均顯著升高(P<0.05)，且出血組患者血清cfDNA顯著高于未出血組(P<0.05)。與對照組相比，不同HVPG組患者血清cfDNA均顯著升高 (P值均<0.05)，且中HVPG組患者血清cfDNA顯著高于低HVPG組(P<0.05)，高HVPG組患者血清cfDNA顯著高于中HVPG組(P<0.05)。對各組患者48個月的生存情況進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，Child-Pugh C級組患者病死率顯著高于Child-Pugh B級組患者，Child-Pugh B級組患者病死率顯著高于Child-Pugh A級組患者(P值均<0.05)；出血組患者病死率顯著高于未出血組(P<0.05)；高HVPG組患者病死率顯著高于中HVPG組患者，中HVPG組患者病死率顯著高于低HVPG組患者(P值均<0.05)。見表1。

表1 不同分組法的乙型肝炎肝硬化患者與對照組血清cfDNA水平和48個月生存情況比較

2.2 臨床資料分析結(jié)果 比較生存組與死亡組之間所有實驗室檢查結(jié)果、臨床模型評分、合并癥的差異，分析得出18項參數(shù)P<0.1，納入下一步回歸分析。見表2。

2.3 單因素Cox回歸分析對預(yù)后有影響的因素 將生存組與死亡組比較后得出的18個預(yù)后因素逐一納入Cox回歸模型中進行單因素分析，對分類變量賦值，其原則：①自發(fā)性細菌性腹膜炎(SBP)、肝腎綜合征，“無”=0，“有”=1；②肝性腦病，“無”=0，“1或2級”=1，“3或4級”=2；③腹水，“無”=0，“少量”=1，“中等或大量”=2；④其余分類變量，“陰性”=0，“陽性”=1。計量資料用實測值或?qū)⑵溥M行對數(shù)變換后進行單因素Cox回歸，共有14項因素與預(yù)后相關(guān)(P值均<0.05)。見表3。

2.4 多因素Cox回歸分析結(jié)果 將單因素Cox回歸分析得出的14項預(yù)后危險因素納入多因素Cox回歸模型進行篩選，結(jié)果顯示腹水量、肝腎綜合征、cfDNA水平、INR、Child-Pugh評分和終末期肝病模型(MELD)評分為預(yù)后不良的危險因素(P值均<0.05)。見表4。

表2 生存組與死亡組比較得出可能影響預(yù)后的參數(shù)

表3 乙型肝炎肝硬化失代償期患者單因素Cox回歸分析對預(yù)后有影響的因素

表4 乙型肝炎肝硬化失代償患者多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.5 血清cfDNA水平評價乙型肝炎肝硬化失代償預(yù)后的效能 以血清cfDNA實測值為檢測變量，以分組為狀態(tài)變量，定義狀態(tài)變量值為1，繪制ROC曲線，見圖1。ROC曲線顯示: 3 406.34 μg/L為最佳截斷值，此時的AUC最大(0.74)，其中，cfDNA>3 406.34 μg/L者64例，占57.1%；cfDNA≤3 406.34 μg/L者48例，占42.9%。提示當cfDNA≤3 406.34 μg/L時，患者預(yù)后好，生存率高；當cfDNA>3 406.34 μg/L時，患者預(yù)后差，病死率高。

2.6 血清cfDNA水平與患者預(yù)后的關(guān)系 以血清cfDNA 3 406.34 μg/L為截斷值，將患者分為低水平cfDNA組與高水平cfDNA組，并繪制累積生存函數(shù)曲線，從圖中得出低水平cfDNA組和高水平cfDNA組24個月的累積生存率分別為89.6%和78.1%，48個月累積生存率分別為68.8%和45.3%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)。見圖2。

圖1 乙型肝炎肝硬化失代償期患者血清cfDNA水平的ROC曲線

圖2 高水平cfDNA組與低水平cfDNA組乙型肝炎肝硬化失代償期患者生存情況比較

3 討 論

cfDNA是釋放到血清中的游離DNA片段，可在血液中自由循環(huán),由小片段(70～200 bp)和較大片段(21 000 bp)組成[4-5]，在健康人和患者的血清中均可檢測出。cfDNA在體液中處于一種動態(tài)平衡過程，已有研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，血清cfDNA水平顯著升高。推測健康人體內(nèi)cfDNA起源于淋巴細胞或其他有核細胞[6-7]，另外有部分cfDNA由受損的組織細胞、炎癥細胞等釋放，因此與很多疾病密切相關(guān)[8-9]。目前，cfDNA可作為一種有效的生物學標志物用于多種疾病的評估，包括但不限于癌癥、胎兒醫(yī)學、創(chuàng)傷、敗血癥、無菌性炎癥和鐮狀細胞貧血等。

乙型肝炎肝硬化是臨床上常見的慢性進行性肝病，如病情持續(xù)進展將進入失代償期，對患者的健康造成極大威脅[10-11]。因此，臨床上亟待尋找一種準確、客觀、實用的檢測指標，用于對患者疾病嚴重程度和預(yù)后的有效評估。目前已發(fā)現(xiàn)乙型肝炎攜帶者血清cfDNA水平顯著高于健康人，同時也有研究指出血清cfDNA水平與乙型肝炎相關(guān)的原發(fā)性肝癌的預(yù)后呈負相關(guān)，表明cfDNA可能是預(yù)測HBV疾病預(yù)后的重要標志物[12]。乙型肝炎患者血清cfDNA水平升高的原因可能為乙型肝炎病毒的復(fù)制導(dǎo)致了肝細胞損傷，并產(chǎn)生大量炎癥因子，此過程中細胞內(nèi)DNA降解為小片段，并釋放進入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清cfDNA水平顯著升高[13-14]。

早期研究只提出cfDNA水平在乙型肝炎患者中顯著升高，并且其血清水平可能與由乙型肝炎肝硬化導(dǎo)致的肝癌具有相關(guān)性。本研究將乙型肝炎肝硬化失代償期患者按照Child-Pugh分級、HVPG、是否合并上消化道出血進行分組，并探討各分組血清cfDNA水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各分組患者血清cfDNA水平均高于對照組，且患者血清cfDNA水平隨著Child-Pugh分級和HVPG升高，以及并發(fā)上消化道出血現(xiàn)象而升高。這一結(jié)果提示血清cfDNA水平與患者病情相關(guān)。

Cox比例風險回歸模型主要用于生存資料的影響因素分析與多變量生存預(yù)測，且可以排除變量之間的相互干擾。本研究采用Cox回歸模型進行單因素和多因素回歸分析，最終篩選出7個對預(yù)后有影響的獨立危險因素，其中血清cfDNA水平也可用于對乙型肝炎肝硬化的預(yù)后評估。采用ROC曲線確定血清cfDNA水平的截斷值，并根據(jù)截斷值將所有研究對象分為高cfDNA和低cfDNA兩組。統(tǒng)計顯示，高cfDNA組患者預(yù)后顯著差于低cfDNA組。本研究提示，血清cfDNA檢測可成為臨床醫(yī)師評估乙型肝炎肝硬化失代償期患者預(yù)后的一種標志物，具有進一步研究的價值。