胰腺部分切除術所致高血糖對腸道菌群的影響及可能機制探討

【摘要】 背景 隨著近年來腸道菌群測序技術的迅速發(fā)展，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與腸道菌群存在密切關系。糖尿病作為威脅人類健康的一大疾病，其與腸道菌群的關系受到廣泛關注。目的 探討血糖升高后腸道菌群的變化及可能機制。方法 將40只雄性SD大鼠采用簡單隨機化分組法分為正常組（n=10，A組）、假手術組（n=10，B組，只開腹切除脾臟）、實驗組（n=10，C組，開腹切除脾臟及部分胰腺）和實驗+干預組〔n=10，D組，在C組基礎上，術后1周開始給予胰島素干預（甘精胰島素注射液，0.1 U/kg，1次/d）〕。術后1、4周四組大鼠行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），觀察各組大鼠血糖變化。術后4周處死大鼠，留取回腸組織，觀察腸道組織形態(tài)變化并行免疫組化測定各組核因子（NF）-κB p65表達變化〔以平均光密度值（AOD值）表示〕；留取糞便并使用測序平臺Illumina MiSeq PE300對腸道菌群的16S rRNA V3～V4可變區(qū)進行測序，并分析四組大鼠腸道菌群的變化。結果 胰腺部分切除術成功復制較為穩(wěn)定的高血糖大鼠模型。顯微鏡下C組回腸腸道黏膜層、黏膜下層、肌層均可見棕色深染，C組AOD值高于A、B組（Plt;0.001）。各組腸道菌群在門水平的相對分布情況存在差異，與A、B組比較，C組和D組厚壁菌門豐度降低，而擬桿菌數(shù)目和變形桿菌豐度增加。α多樣性稀釋曲線顯示，按物種豐富程度從低到高排序依次為：A組lt;D組lt;B組lt;C組。各組內群落分布較為聚集，說明組內標本重復性較好，較為穩(wěn)定。A組與B組間物種組成最相似，基本位于同一象限；C組和D組物種分別聚集于另外兩個象限。結論 血糖升高可激活NF-κB信號通路導致腸道發(fā)生炎性改變，從而造成腸道菌群紊亂，主要門水平表現(xiàn)為厚壁菌門豐度明顯降低，而擬桿菌門和變形菌門的豐度顯著增加。

【關鍵詞】 高血糖；核因子-κB；胃腸道微生物組；腸道菌群；16S rRNA；大鼠

【中圖分類號】 R 587.1 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.040

郭來麗，王靜，李婷婷，等．胰腺部分切除術所致高血糖對腸道菌群的影響及可能機制探討［J］．中國全科醫(yī)學，2021，24（33）：4234-4240. ［www.chinagp.net］

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Possible Mechanism of Action of Hyperglycemia Caused by Partial Pancreatectomy on Gut Floras in a Rat Model GUO Laili1，WANG Jing1，LI Tingting1，BAI Xiuping2*

1.The Second Clinical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

2.Department of Endocrinology，Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

*Corresponding author：BAI Xiuping，Professor；E-mail：xiupingbai@sina.com

Note：GUO Laili and WANG Jing are co-first authors

【Abstract】 Background Recent rapid development of sequencing technology improves the understanding of the close association between gut floras and an increasing number of diseases. The relationship of gut floras with diabetes，a primary disease threatening human health，has attracted extensively attention. Objective To explore the changes of gut floras in a rat model with elevated blood glucose due to partial pancreatectomy and the possible mechanism. Methods Forty male SD rats were equally randomized into four groups：group A（no interventions），group B（treated with open total splenectomy），group C（treated with open total splenectomy and partial pancreatectomy），and group D〔treated with open total splenectomy，partial pancreatectomy，and administration of insulin glargine injection（0.1 U/kg），once daily at one week after the surgery〕. The oral glucose tolerance test was performed in all groups at the first and fourth weeks after the initiation of the study to test the blood glucose. The rats were sacrificed at the end of the fourth week of study，and the ileal tissues were taken out for pathologically examining morphological changes. The NF-κB p65 expression 〔expressed as average optical density（AOD）〕 in ileal tissues was detected using immunohistochemistry. Gut floras in fecal specimens were assessed by sequencing the 16S rRNA V3-V4 variable regions using the Illumina MiSeq （PE300） sequencing platform. The changes in gut microbiota were analyzed comparatively. Results The rat model of stable hyperglycemic was successfully created by using partial pancreatectomy. Dark brown staining was seen in the mucosal，submucosal，and muscular layers of the ileal intestine in group C under microscopy. The AOD value of NF-κB p65 expression in group C was more elevated than that of group A or B （Plt;0.05）. Sequencing of gut floras of four groups of rats found that the relative distribution of the gut flora of each group at the phylum level was significantly different. Group C had decreased abundance of Firmicutes，increased number of Bacteroides and increased abundance of Proteus compared with groups A and B，and so did group D. The α-diversity expressed by dilution curve showed that the order of species richness from low to high was：group Alt;group Dlt;group Blt;group C. The community distribution was relatively concentrated in each group，indicating that the group's specimen repeatability was good and stable. The species composition of groups A and B were the most similar，which were located in the same quadrant. The specimens of groups C and D were clustered in the other two quadrants，respectively. Conclusion Elevated blood glucose may activate the NF-κB signaling pathway，leading to inflammatory changes in the intestines，which would result in intestinal flora disorders，mainly presented as significantly decreased abundance of Firmicutes，and considerably increased abundance of Bacteroides and Proteus at the phylum level.

【Key words】 Hyperglycemia；NF-kappa B；Gastrointestinal microbiome；Intestinal flora；16S rRNA；Rats

目前，糖尿病已成為威脅人類健康的主要慢性代謝性疾病之一。第八版國際糖尿病聯(lián)盟（IFD）報告顯示，目前全球約有糖尿病患者4.25億，預計到2045年，這一數(shù)字可能增加至7億［1］。研究表明，血糖升高與腸道炎癥以及腸道菌群的變化有密切的關系［2］。因此建立密切模仿人類糖尿病和代謝綜合征發(fā)生后變化的獨特動物模型顯得至關重要。目前，糖尿病模型建立的方法包括化學藥物誘導法、轉基因動物以及手術切除等［3-4］。由于轉基因動物制作糖尿病模型成本較高，化學藥物誘導法對實驗動物臟器本身易產生嚴重影響等缺點［5-6］，而胰腺大部切除所致糖尿病模型死亡率較高，故本實驗采用胰腺部分切除術制作高血糖大鼠模型進行研究，以期探討糖尿病前期血糖升高對腸道菌群的影響及可能機制，為糖尿病及其并發(fā)癥的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 實驗動物：選取體質量為（200±30）g的SD大鼠40只（雌雄不拘，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心）。在通風良好、室溫22～26 ℃、濕度35%～60%的環(huán)境中，統(tǒng)一選用標準飼料進行喂養(yǎng)，不限制飲水，適應性飼養(yǎng)1周。使用簡單隨機化分組法分成正常組（n=10，A組），假手術組（n=10，B組），實驗組（n=10，C組），實驗+干預組（n=10，D組）。

1.2 實驗方法 A組：不做處理。B組行脾臟切除術，按3.5 ml/100 g比例使用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉后，在無菌環(huán)境下開腹但不切除胰腺、僅切除脾臟，術后肌肉注射青霉素5萬U/100 g。C組行胰腺大部切除術，按3.5 ml/100 g比例使用10%水合氯醛腹腔內注射麻醉后，在無菌環(huán)境下開腹切除大鼠gt;70%胰腺，切除范圍包括脾臟及十二指腸曲中大部分胰腺組織，術后給予青霉素5萬U/100 g肌肉注射預防感染。D組手術處理同C組，術后1周開始給予甘精胰島素注射液，0.1 U/kg，1次/d，連續(xù)干預3周。

1.3 監(jiān)測指標 術后四組大鼠分別于1、4周時行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）：大鼠禁食5 h后，于尾靜脈采血測定空腹血糖，之后采用50%葡萄糖溶液按體質量5 g/kg灌胃，并分別于0.5、1.0 h及2.0 h測定血糖并記錄（采用三諾血糖儀測定）。4周時取回腸組織留做病理；HE染色：取四組大鼠胰回腸組織，制成石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察。免疫組化檢測（SP法）：采用核因子（NF）-κB p65（K303）抗體（一抗及試劑盒均由武漢博士德公司提供）對大鼠回腸組織進行切片免疫組化染色（一抗?jié)舛?∶100），用Image J軟件分別對各組大鼠腸道免疫組化結果進行定性及定量分析，通過測定陽性表達面積（Area）及總光密度值（IOD值）計算得出平均光密度值（AOD值），明確各組NF-κB p65抗體表達量。4周時留取四組大鼠糞便并置于潔凈EP管中，測定腸道菌群，具體步驟如下：樣品預處理后提取DNA，DNA樣本質檢后，將PCR管置于PCR儀中進行擴增，文庫質控，上機后利用Illumina Miseq測序，最后進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 物種多樣性分析 α多樣性指數(shù)分析：群落生態(tài)學中研究微生物多樣性時主要通過α多樣性反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)估計物種群落的物種豐度和多樣性。Shannon值是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)之一，其與Simpson常用于反映α多樣性。Shannon值越大說明群落多樣性越高，Simpson越大說明群落多樣性越低。Chao采用Chao1算法估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)。Ace是用來估計群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，是生態(tài)學中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao1的算法不同。Shannoneven是一個用于反映物種個體數(shù)目在群落中分配的均勻程度的指數(shù)，反映一個群落或環(huán)境中全部物種個體數(shù)目的分配狀況。α多樣性稀釋曲線是指從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列并統(tǒng)計這些序列對應樣本的α多樣性指數(shù)，以抽取的數(shù)據(jù)量為橫軸、以對應的OUT個數(shù)值為縱軸繪制的曲線，最后根據(jù)曲線是否平緩來判斷本次測序數(shù)據(jù)量是否足夠，可以直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，間接體現(xiàn)不同組之間物種的豐富程度。β多樣性分析主要用于對不同組大鼠糞便中微生物群落的構成差異進行比較。PCA分析（principal component analysis）即主成分分析，是一種對數(shù)據(jù)進行簡化分析的技術，能有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結構，將原有的復雜數(shù)據(jù)通過降維找到隱藏在復雜數(shù)據(jù)背后的簡單結構并通過分析不同樣本群落組成反映樣本間的差異和距離，同時PCA運用方差分解將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大限度地反映樣品間差異的兩個特征值，而樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 監(jiān)測指標 實驗1周時，干預方法與時間對血糖的影響存在交互作用（Plt;0.05）；干預方法和時間對血糖的影響，主效應均顯著（Plt;0.05）。0.5、1.0、2.0 h時，C組血糖高于B組；1.0、2.0 h時，D組血糖高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），見表1。

實驗4周時，干預方法與時間對血糖的影響存在交互作用（Plt;0.05）；干預方法和時間對血糖的影響，主效應均顯著（Plt;0.05）。0.5、1.0、2.0 h時，C組血糖高于B組；2.0 h時，D組血糖高于B組；0.5 h時，D組血糖低于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），見表2。

2.2 腸道組織病理學分析

2.2.1 腸道HE染色結果 A組大鼠回腸組織HE鏡下見腸黏膜完整，上皮絨毛排列致密而整齊，其內的炎性細胞、杯狀細胞以及空泡較少；黏膜肌層完整，無明顯損傷，其內無炎性細胞浸潤。B組大鼠回腸腸道上皮絨毛及隱窩排列與A組比較無明顯變化，腸黏膜上皮有少量的炎性細胞、空泡和杯狀細胞。C組大鼠鏡下回腸腸道絨毛有斷裂、排列紊亂、間隙變寬、隱窩結構改變，內見杯狀細胞及空泡狀結構增多；黏膜下層炎性細胞浸潤較明顯；黏膜肌層少量炎性細胞浸潤。D組大鼠回腸腸道上皮絨毛稀疏、排列較為紊亂；黏膜下層可見少量炎性細胞浸潤。見圖1。

2.2.2 各組大鼠腸道局部NF-κB p65的表達 顯微鏡下C組回腸腸道黏膜層、黏膜下層、黏膜肌層均可見棕色深染，與其他組比較陽性面積更大，且部分組織呈強陽性，見圖2。A組AOD值為（0.17±0.03），B組為（0.21±0.04），C組為（0.27±0.02），D組為（0.24±0.05），各組大鼠腸道局部AOD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.229，Plt;0.01），其中C組AOD值高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）。

2.3 腸道菌群變化分析

2.3.1 腸道菌群在門水平優(yōu)勢物種相對豐度比較 各組腸道菌群在門水平的相對分布情況存在差異，A組主要以厚壁菌門為主（約占96%），其次為擬桿菌門（約占3%）；B組同樣以厚壁菌門（約占88%）及擬桿菌門（約占10%）為主；C組以厚壁菌門（約占74%）和擬桿菌門為主（約占20%）；D組以厚壁菌門（約占52%）及疣微菌門（約占40%）為主，其次為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門，約各占2%，疣微菌門顯著增高的原因可能與胰島素干預有關。此外，C組和D組出現(xiàn)糖酵母念珠菌，且經過胰島素干預，D組較C組顯著減少。見圖3。

2.3.2 腸道菌群α多樣性分析

2.3.2.1 α多樣性稀釋曲線 不同組別大鼠的α多樣性稀釋曲線均接近平緩，說明測序深度已經達到要求，數(shù)據(jù)量已經足夠，目前測序深度已經可以真實反映腸道菌群的構成，見圖4。此外，α多樣性稀釋曲線還可以間接反映不同樣品中物種的豐富程度，從達到飽和狀態(tài)時的數(shù)據(jù)可以看出，四組按物種豐富程度從低到高排序依次為：A組lt;D組lt;B組lt;C組，說明隨著血糖變化，腸道菌群物種豐富程度發(fā)生了明顯變化，考慮可能與血糖升高為微生物提供了有利的生長繁殖環(huán)境有關。在糖尿病發(fā)生過程中，腸道菌群的變化和血糖的變化相互影響。

2.3.2.2 多樣性指數(shù)分析 各組Number、OTUs、Shannon、Chao、Ace、Simpson、Shannoneven比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），其中C組Shannon、Shannoneven均高于A組和B組，Simpson低于A組和B組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；D組Shannon、Shannoneven低于C組，Simpson高于C組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；B組、C組、D組Chao、Ace高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表4。

2.3.3 腸道菌群β多樣性分析 各組內群落分布較為聚集，說明組內標本重復性較好，較為穩(wěn)定。A組與B組間物種組成最相似，基本位于同一象限；C組和D組物種分別聚集于另外兩個象限，見圖5。由此可知腸道菌群與血糖變化有著密切的關系。

3 討論

隨著物質生活水平的提高，人們飲食結構發(fā)生重大變化。飲食中攝入鹽、糖和脂肪量的明顯增多導致肥胖癥、糖尿病等慢性代謝性疾病的發(fā)病率明顯升高，糖尿病已然成為世界范圍內日益突出的健康問題。近些年一系列研究發(fā)現(xiàn)：腸道菌群和環(huán)境、遺傳、飲食因素一樣在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。目前腸道菌群越來越被認為是影響人類健康的關鍵因素之一。多項研究表明人類的多種慢性疾病可能與腸道菌群紊亂有關［7-12］。

3.1 關于高血糖大鼠模型的制作 目前，建立高血糖大鼠模型的方法有手術切除胰腺法、化學藥物誘導法及轉基因動物等。由于轉基因動物成本較高，化學藥物誘導法對實驗動物相關臟器易產生影響，以及胰腺大部切除術死亡率高等缺點，本研究選用改良后的胰腺部分切除術造模。實驗1周時，筆者通過觀察大鼠一般生活狀態(tài)發(fā)現(xiàn)C組大鼠出現(xiàn)明顯的飲水增加，1周時OGTT結果顯示A組、B組大鼠OGTT無差異，說明手術對血糖變化的影響可以忽略，C組與B組比較血糖值明顯升高；4周時，OGTT結果顯示C組與B組比較，多個時間點血糖值仍有明顯升高，說明胰腺部分切除術可以成功制作高血糖大鼠模型；D組與C組大鼠比較，0.5、1.0、2.0 h血糖值均下降，0.5 h血糖值下降明顯，說明給予胰島素干預后血糖下降，可為進一步研究血糖波動對腸道菌群的影響作干預對照。

3.2 腸道菌群變化及可能機制 腸道菌群被認為是一個由500～1 000種細菌組成的新的復雜的器官。人類腸道菌群包含人類腸道中的微生物、微生物的基因組以及腸道的環(huán)境條件。所有腸道微生物的基因組被稱為“微生物組”［13］。根據(jù)功能，微生物可分為三類：有益菌、有害菌和條件致病菌。在門水平上90%的細菌為厚壁菌門和擬桿菌門，其次為變形菌門和放線菌門，而其他細菌只占很小的比例。厚壁菌門是腸道內含量最高的一類細菌，又分為梭菌綱、芽孢桿菌綱、柔膜菌綱，其中梭菌綱占主要地位，其下的乳酸桿菌菌屬作為益生菌被人們熟知，可以促進腸蠕動，分解有害物質。作為數(shù)量僅次于厚壁菌門的第二大優(yōu)勢菌，擬桿菌門主要包括擬桿菌屬，研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬參與多糖代謝、類固醇以及膽汁酸代謝，對維持人體健康有重要作用。變形菌門在正常機體中含量比較低，多數(shù)為致病菌，常見的致病菌包括腸桿菌科、假單胞菌科。放線菌門是一類嚴格厭氧菌，數(shù)量明顯少于前三種菌門，但其門下的雙歧桿菌作用與乳酸桿菌一樣，在腸道中較為常見。隨著近年來腸道菌群測序技術的迅速發(fā)展，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)與腸道菌群有著緊密的聯(lián)系，糖尿病作為威脅人類健康的一大類疾病，其與腸道菌群的關系受到廣泛的關注，大量的研究對糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中腸道菌群的變化以及可能的作用機制進行了深入探討，為糖尿病的預防及診治提供了新思路。本研究從血糖升高對腸道菌群產生的影響這一角度出發(fā)，探究血糖升高以后腸道菌群變化。

通過對四組大鼠的腸道菌群進行測序發(fā)現(xiàn)：各組的腸道菌群在門水平的相對分布情況存在明顯差異，正常組主要以厚壁菌門為主（約96%），其次為擬桿菌門（約3%）；假手術組同樣以厚壁菌門（約88%）及擬桿菌門（約10%）為主；實驗組（C組）厚壁菌門占比較正常組和假手術組明顯降低，約為74%，擬桿菌門占比明顯增加，約為20%，實驗組糖酵母念珠菌較其他組明顯增加；實驗+干預組（D組）以厚壁菌門（52%）及疣微菌門（40%）為主，其次為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門，約各占2%。鑒于上述研究結果，考慮血糖升高會導致厚壁菌門相對豐度降低，擬桿菌門豐度增加，這可能由于高糖環(huán)境不利于厚壁菌門微生物的生長繁殖，而擬桿菌門參與體內代謝，血糖升高后會刺激擬桿菌門的生長繁殖來維持體內代謝平衡。實驗+干預組變形菌門較正常組及假手術組明顯增加，考慮其與血糖升高、機體抵抗力降低導致有害菌滋生有關，而實驗+干預組雖然給予了胰島素治療，但長期的腸道菌群結構的紊亂短期內依然無法恢復正常。此前已有研究證實產短鏈脂肪酸細菌菌屬多數(shù)來源于厚壁菌門，故血糖升高會導致短鏈脂肪酸的合成減少，進而引起脂肪代謝和葡萄糖代謝異常，但是目前關于腸道菌群與血糖關系的研究結果仍然存在爭議，而研究結果不一的原因可能與研究數(shù)量及所在地區(qū)不同有關。

本研究結果顯示：腸道病理鏡下觀察實驗組腸道絨毛有斷裂、排列紊亂、間隙變寬、隱窩結構改變，內見杯狀細胞及空泡狀結構增多，黏膜下層炎性細胞浸潤較明顯，少量炎性細胞浸潤至黏膜肌層。在各種炎性反應的通路中，NF-κB信號轉導通路起著關鍵作用。本研究對腸道組織行NF-κB p65抗體的免疫組化發(fā)現(xiàn)：顯微鏡下實驗組回腸腸道黏膜層、黏膜下層、黏膜肌層均可見棕色深染，而其他組僅一些部位呈弱陽性表現(xiàn)。采用Image J行定量分析發(fā)現(xiàn)：實驗組NF-κB p65表達量較正常對照組顯著升高，與假手術組比較表達量也升高；實驗+干預組與實驗組比較，NF-κB p65表達量雖降低，但不具有統(tǒng)計學意義。上述研究結果說明血糖升高可激活NF-κB信號通路，進而促使炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生，導致腸道菌群結構發(fā)生一系列炎性改變。眾多研究表明腸道的炎性改變會進一步導致腸道菌群結構發(fā)生變化，進而引起腸道菌群失調，產短鏈脂肪酸細菌減少，腸道內短鏈脂肪酸生成量減少并使得激活短鏈脂肪酸受體的能力減弱，造成脂肪代謝和葡萄糖代謝異常，進而導致2型糖尿病的發(fā)生；此外，腸道菌群結構改變還會進一步導致內毒素代謝血癥的發(fā)生，進一步加重腸道炎癥。由此可見血糖的變化、腸道炎癥以及腸道菌群之間聯(lián)系緊密、互相影響。

綜上所述，血糖升高可激活NF-κB信號通路，導致腸道發(fā)生炎性改變，從而腸道菌群發(fā)生紊亂，主要門水平表現(xiàn)為厚壁菌門豐度明顯降低，而擬桿菌門和變形菌門的豐度則顯著增加。

作者貢獻：郭來麗進行文章的構思與實驗的設計，數(shù)據(jù)收集，撰寫論文；王靜進行實驗的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)整理，結果的分析與解釋；李婷婷進行統(tǒng)計學處理，論文的修訂；白秀平負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2021-03-13；修回日期：2021-07-05）

（本文編輯：賈萌萌）