不同產地柴胡的HPLC指紋圖譜與有效成分分析

董蘇瑩，杜靈均，王安琪，尹 鑫，周志杰，田曄林*

(1.北京農學院 園林學院，北京 102206；2.北京農業職業學院，北京 102442； 3.承德市農林科學院，河北 承德 067000)

柴胡作為常用的中藥材之一，在中國使用歷史悠久，具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽氣之功效,為中醫治療少陽證的首選要藥[1-5]。柴胡最早被記載是在《神農本草經》中，該書將中藥材分為上、中、下三品，柴胡被列為上品[6-10]。《中國藥典》2015年版一部收載的柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”[11]。據報道在全球約有200種柴胡屬植物，主要在歐亞大陸及北非有分布[12]，中國已報道的柴胡屬植物有42種，17個變種及7個變型[13]。1916年惠澤等報道了柴胡中的主要有效成分為柴胡皂苷[14]，其中柴胡皂苷a、d的生物活性最強。柴胡皂苷a是柴胡抗癲癇作用的主要生物活性成分，柴胡皂苷d具有抑制肝組織纖維化、抑制肝臟癌細胞增殖的功能[15]。皂苷類成分主要在柴胡的根部，而地上部分則很少[16]。

高效液相色譜法(HPLC)具有分離效能高，分析速度快等優點，被廣泛用于定性定量分析中藥材及其制劑有效成分[17]。由于中藥的成分較為復雜，選用高效液相色譜法構建中藥指紋圖譜時，一般多采用梯度洗脫的方法，這樣能夠分開中藥中的大多數成分，因而能更準確、充分地揭示中藥的鑒別信息[18]。本研究以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為參照組分，通過HPLC法，對不同產地的柴胡進行指紋圖譜研究，為柴胡的質量評價和種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共收集了11個不同產地的柴胡樣品(表1)(由田曄林副教授鑒定，保存于北京農學院園林樓)，測試樣品為陰干處理的干燥的根。

表1 材料來源Tab.1 Origin of Bupleuri Radix

1.2 分析方法

1.2.1 儀器 研磨儀(Retsch GmbH MM400)、篩子(孔徑0.25 mm)、超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)、旋轉蒸發儀(RE-52)、高效液相色譜儀(Waters2695)、檢測器(waters2998 PAD)、Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)(天津艾杰爾生物公司)。

1.2.2 試劑 濃氨水、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、蒸餾水、柴胡皂苷a標準品(E-0239)、柴胡皂苷d標準品(E-0240)(購自上海同田生物有限公司)。

1.2.3 溶液的制備 分別稱取一定量的柴胡皂苷a、d對照品，加入甲醇，制成0.4 mg/L的柴胡皂苷a溶液，0.5 mg/L的柴胡皂苷d溶液，搖勻。

將柴胡用研磨儀打成粉末狀，0.25 mm孔徑過篩后稱取0.5 g，置于50 mL塑料管中，加入25 mL含5%濃氨試液的甲醇溶液，密塞，超聲處理(功率600 W,頻率40 kHz)30 min，水溫為30 ℃，濾過，用20 mL甲醇分為2次進行容器和藥渣的洗滌，洗液與濾液混合，用旋轉蒸發儀回收溶劑至干。加入適量甲醇溶解殘渣，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用注射器吸取2 mL溶液，后用0.22 μm濾膜過濾至色譜進樣瓶中，做好樣品標記。

1.2.4 高效液相色譜測定 使用Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)，以乙腈為流動相A，水為流動相B，等度洗脫，皂苷a A∶B=40∶60,皂苷d A∶B=45∶55；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為210 nm。測定時精密吸取20 μL進行測定。

1.2.5 線性關系考察 取1.2.3中制備好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標準品溶液，將進樣量分別設置為2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，上機檢測后以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果柴胡皂苷a回歸方程為y=296 809x-35 248，R2=0.999 6，柴胡皂苷d回歸方程為y=304 388x-94 946，R2=0.999 4。

1.2.6 精密度考察 取1.2.3中制備好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標準品溶液，設置每次進樣量20 μL，連續6次進樣，通過所得圖譜進行計算。計算得出柴胡皂苷a的RSD為1.10%，柴胡皂苷d的RSD為0.75%，表明儀器精密度良好。

1.2.7 重復性考察 用1.2.3方法制備2號柴胡樣品6份，設置每次進樣量20 μL，連續6次進樣。計算得出柴胡皂苷a的RSD為2.25%，柴胡皂苷d的RSD為3.27%，表明重復性良好。

1.2.8 穩定性考察 用1.2.3方法制備2號柴胡樣品一份，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h進樣進行上機檢測，進樣量20 μL。計算得出柴胡皂苷a的RSD為1.85%，柴胡皂苷d的RSD為0.50%，表明室溫下混合對照品溶液在48 h內進行測定，試驗結果穩定。

1.2.9 加樣回收率考察 用1.2.3方法制備2號柴胡樣品并加入1 mg柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標準品制備成混合溶液，通過色譜儀進行檢測，進樣量20 μL。計算得出柴胡皂苷a的加樣回收率為100.73%，RSD為1.65%；柴胡皂苷d的加樣回收率為95.56%，RSD為1.02%。

1.2.10 不同產地柴胡HPLC指紋圖譜的建立 利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件進行指紋圖譜的建立及相似度計算，根據生成峰圖進行試驗數據分析，并驗證試驗的準確性。

2 結果與分析

2.1 不同產地柴胡皂苷a的含量及色譜圖

通過高效液相色譜儀上機檢測，11個不同產地的柴胡進樣量均為20 μL，藥用成分柴胡皂苷a含量測定結果如表2所示，色譜結果如圖1所示。

從表2中可以看出，11個柴胡藥材樣品中柴胡皂苷a的含量從高到低依次是甘肅人工種植兩年生柴胡(2.654%)、海升堂藥店購買柴胡(1.705%)、河北承德人工種植兩年生柴胡(1.449%)、陜西人工種植三年生柴胡(1.012%)、同仁堂藥店購買柴胡(0.865%)、東北野生柴胡(0.553%)、河北承德人工種植三年生柴胡(0.389%)、山西人工種植兩年生柴胡(0.302%)、隆化野生柴胡(0.222%)、豐寧野生柴胡(0.178%)、海拉爾野生柴胡(0.101%)。最后三個地點的柴胡皂苷a的含量未達到中國藥典的標準。

表2 11個不同產地柴胡的柴胡皂苷a和皂苷d含量Tab.2 Contents of saikosaponin a in Bupleuri Radix from 11 different habitats

2.2 不同產地柴胡皂苷d的含量及色譜圖

通過高效液相色譜儀上機檢測，11個不同產地的柴胡的藥用成分柴胡皂苷d含量測定結果如表2所示，色譜結果如圖2所示。從表2中可以看出，11個柴胡樣品中柴胡皂苷d的含量從高到低依次是甘肅人工種植兩年生柴胡(3.287%)、陜西人工種植三年生柴胡(1.619%)、同仁堂藥店購買柴胡(1.495%)、海升堂藥店購買柴胡(1.490%)、河北承德人工種植2年生柴胡(0.756%)、東北野生柴胡(0.734%)、海拉爾野生柴胡(0.538%)、河北承德人工種植三年生柴胡(0.485%)、隆化野生柴胡(0.441%)、山西人工種植兩年生柴胡(0.416%)、豐寧野生柴胡(0.115%)。僅豐寧的未達到中國藥典的標準。

2.3 不同產地柴胡皂苷a和柴胡皂苷d總含量

通過對表2中柴胡皂苷a、d總含量的計算可以看出，不同產地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d總含量在0.292%～5.941%之間，總含量最高的比最低的高出5.649%，其中甘肅人工種植兩年生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量最高，為5.941%，豐寧野生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量最低，為0.292%。通過對表中的數據進行分析發現，來自河北地區的4個柴胡樣品中，野生柴胡的柴胡皂苷a、d的總含量低于人工種植柴胡。還發現山西產柴胡的柴胡皂苷a、d的總含量低于甘肅產，這與余菁等[19]研究結果相一致。

《中國藥典》2015年版一部中規定北柴胡的柴胡皂苷a、d的總量最低為0.30%[20]，分析實際所得數據發現，除豐寧野生柴胡以外，其他地區的總量均在0.30%以上，最高者可達5.941%。

2.4 不同產地柴胡皂苷a、d的HPLC指紋圖譜匹配建立及相似度評價

分別以柴胡皂苷a、d標準品為參照圖譜生成對照峰R(圖3)，進行多點校正。通過色譜圖上重疊峰進行對比，非共有峰所占比例較大。通過圖譜之間對比，柴胡樣品間皂苷含量和出峰時間存在明顯

差異，是生長區域和生長環境不同導致的[6,21]。

將色譜圖匹配到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》中，通過相似度軟件進行計算，結果如表3所示，與對照圖譜進行對比，柴胡皂苷a的相似度在0.106～0.937之間，柴胡皂苷d的相似度在0.029～0.955之間。

表3 柴胡皂苷a、d相似度結果Tab.3 Similarity results of saikosaponin a and d

3 討論與結論

3.1 柴胡皂苷含量與生長地域相關

本研究的11個樣品分別來自于陜西省(1個)、甘肅省(1個)、河北省(4個)、內蒙古(1個)、山西省(1個)、北京(2個)和東北地區(1個)。通過數據分析可以發現，11個產地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量存在差異。其中甘肅省、陜西省柴胡的柴胡皂苷含量較高，與王硯等的研究得出的西北地區柴胡品質較高相一致[22]。有文獻報道指出藥材生長環境不同，溫度、濕度和光照會對藥用植物成分積累產生較大影響[23],環境的差異是造成不同產地柴胡含量的不同的主要原因[6,22]。

3.2 柴胡皂苷含量與生長方式相關

本研究采集的樣品有人工種植樣品和野生樣品。其中S1、S2、S4、S8、S9為人工種植樣品，S3、S5、S10、S11為野生樣品，S6、S7未知。人工種植樣品的柴胡皂苷含量均達標，而野生樣品中豐寧地區的柴胡皂苷含量未達標。通過對柴胡皂苷含量的對比發現，人工種植柴胡的柴胡皂苷含量明顯高于野生柴胡的皂苷含量，這與楊洋的研究結論一致，即人工種植的柴胡從色澤、形狀、品質到適應性均優于野生柴胡種[24]，但野生柴胡資源仍作為主要資源應用于市場。

3.3 柴胡皂苷含量與生長年限相關

本研究中人工種植柴胡有兩年生和三年生。其中S2、S4、S8為兩年生，S1、S9為三年生，S6、S7未知。通過對比發現，各樣品間柴胡皂苷含量差異顯著，甘肅兩年生的柴胡皂苷含量最高，河北承德人工種植兩年的柴胡品質優于三年的，野生樣品生長年限不詳。建議甘肅和河北承德地區種植的柴胡兩年采收，既可以提高土地利用率，也可以降低柴胡根腐病的發生，提高柴胡的品質。

通過對色譜圖的相似度分析發現樣品間化學成分相似度極高，說明樣品全部為中藥材柴胡，但對重疊峰進行對比可以發現，柴胡樣品的非共有峰所占比例較大，表明各樣品間差異明顯。這不僅反映出柴胡中藥用成分的質量含量在不同產區有一定的差異，也反映了柴胡在中藥材市場中存在質量不一的情況。有利于市場北柴胡的質量監督[13]。

柴胡皂苷a含量最高的是來源于甘肅的柴胡，含量為2.654%，最低的是海拉爾野生柴胡，含量為0.101%；柴胡皂苷d含量最高的是甘肅柴胡，含量為3.287%，最低的是豐寧野生柴胡，僅0.115%。野生柴胡的含量沒有人工種植的含量高，建議規范柴胡人工種植技術，其中西北地區柴胡品質優良，建議在西北地區建立種植基地。