金釵石斛雌配子體和胚的發育過程分析

張艷慧，鄭寶強，繆 崑，侯芳梅，王 雁*

(1.國家林業局林木培育重點實驗室/中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091； 2. 北京農學院 園林學院，北京102206)

石斛蘭(Dendrobium)是蘭科石斛屬植物的總稱，為蘭科(Orchidaceae)的第二大屬[1]。石斛屬植物有著極高的觀賞價值，與卡特蘭(Cattleya)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis)、文心蘭(Oncidium)同為世界上四大觀賞洋蘭[2]。隨著人們對觀賞石斛消費需求的擴大，觀賞石斛的育種已成為越來越關注的熱點[3]。有研究表明石斛屬內有很多種有自交不親和現象，部分種也有異交不親和現象[4]，所以研究石斛屬植物胚發育是解決雜交敗育及進行胚搶救育種的第一步。

蘭科植物中授粉后花粉管的長出會刺激大孢子的發育和雌配子體的形成，持續50～90 d。從授粉到果實成熟需要6～8個月。授粉后6周左右，大花杓蘭(Cypripediummacranthum)的種胚發育為球形胚[5]。無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)授粉后60 d，合子形成完成受精，合子第一次橫向分裂為基細胞和頂細胞，頂細胞發生縱裂，之后經過數次胚細胞的分裂形成成熟的胚胎[6]。扇脈杓蘭(Cypripediumjaponicum)授粉前，子房的胎座有稍許分化，在胎座形成一些突起。在授粉10 d后，胎座分化出隆起的胚珠原基，胚原基頂端的孢原細胞，分化為具有明顯細胞核的大孢子母細胞，之后胚原基基部的細胞突起形成內珠被，然后外珠被開始發育。授粉后35 d，發育成熟的雌配子體準備好受精。受精后經95 d胚胎發育成熟，其胚胎發育過程和無距蝦脊蘭類似，也為石竹型[7]。

本研究旨在通過對金釵石斛(Den.nobile)大孢子發生、雌配子體發育以及胚發育等進行研究，為石斛屬植物生殖生物學研究提供相關資料，為研究石斛屬雜交育種敗育現象奠定基礎。

1 材料與方法

試驗材料為中國林科院科研溫室內的金釵石斛。于2017年2、3月份對金釵石斛開花植株進行人工授粉、標記。金釵石斛授粉后每隔10 d取1次果莢，每次3個，以授粉前子房為對照，將樣品切塊放在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中，經1%的鋨酸室溫固定，然后將樣品依次經過50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液脫水。逐步完成丙酮和Spurr樹脂的置換和浸透，樣品放入新配制的Spurr樹脂中靜置1 h后放入60 ℃烘箱中24 h完成包埋與聚合，將包埋好的樣品用超薄切片機切片，切片厚度3 μm，在切片上滴加數滴濃度為0.5%的甲苯胺藍溶液，染色3～4 min后，用蒸餾水沖洗干凈，在光學顯微鏡下觀察然后拍照。

2 結果與分析

2.1 大孢子發生和雌配子體發育

金釵石斛的子房為側膜胎座三心皮(圖1-A)，在授粉前，胎座未發育(圖1-B)。授粉后，胎座之間空隙變大，胎座上細胞開始迅速增殖分裂，在內膜脊上形成指狀突起，授粉后10 d每個胎座上分化出一些小枝(圖1-A)。授粉后20 d，每個胎座上的小枝又繼續分化，指狀突起數量變多(圖1-C,D)。隨著胎座小枝上細胞持續分裂，子房不斷膨大。授粉后30 d，指狀突起分化為成千上萬個胚珠原基，由一列細胞外加一層表皮細胞組成，位于胚珠原基末端的細胞體積增大變為孢原細胞(圖1-E)。

授粉后40 d，相對于其他細胞，體積明顯增大，孢原細胞變為細胞核明顯的大孢子母細胞(圖1-F)。隨著大孢子母細胞的體積不斷增大，胚珠原基開始彎曲，最后整個胚珠體發生180度的轉換(圖1-G)，珠柄與珠孔靠近，形成倒生型胚珠。孢原細胞發育為大孢子母細胞之后，胚珠原基基部的表皮層細胞向外突起生長形成衣領狀結構，為內珠被(圖1-G)。隨后，外珠被也開始發生，由內珠被靠近底部的細胞分化而來(圖1-H)。在受精前，內珠被不斷向上生長，包住大孢子母細胞，在雌配子體成熟前后內珠被生長完成，包住珠心，形成珠孔。隨著內珠被的不斷生長，大孢子母細胞也不斷伸長(圖1-I)。

授粉后60 d左右，大孢子母細胞體積不再繼續擴增，準備進行減數分裂。大孢子母細胞減數第一次分裂是橫向的，產生2個不對稱的細胞(圖1-J)，靠近珠孔方向的細胞較小很快便壓縮退化(圖1-K)，合點方向的功能性二分體細胞較大，接下來發生橫軸方向上的減數第二次分裂，形成具有4孢子的直列式四分體， 4個孢子中只有1個參加雌配子體的發育(圖1-L)，其余3個在四分體形成的過程中先后退化。參加雌配子形成的大孢子進行有絲分裂，第一次分裂形成初生珠孔核和初生合點核(圖1-M)；第二次分裂珠孔方向產生一對核，合點方向產生一對核(圖1-N)；第三次分裂珠孔方向和合點方向各形成4個核，這種由單孢子分裂形成的八核胚囊稱為蓼型胚囊(圖1-O)。從授粉到雌配子體成熟大約需要70 d的時間，但即使是同一子房其雌配子體發育的時間也不完全一致。

2.2 受精后胚的發育

配子結合形成受精卵后，細胞質呈均勻狀態(圖2-A)。授粉后80 d合子進行第一次分裂，分裂為兩個細胞，包括1個基細胞和1個頂細胞(圖2-B)，頂細胞在合點方向，細胞體積小，基細胞靠近珠孔方向，液泡很大，基細胞之后會分化為胚柄，胚柄起固定胚體的作用，其他組織細胞的養分可以通過胚柄運輸至胚。授粉后90 d，金釵石斛的頂細胞發生橫軸方向上的分裂，基部的細胞不分裂，形成一列三細胞原始胚(圖2-C-D)，依此判斷金釵石斛的胚發生類型為石竹型。但偶有切片觀察發現頂細胞首次分裂為縱軸方向上的分裂(圖2-E)。一列三細胞原胚接下來的分裂也分為兩種情況：原胚頂端細胞發生縱軸方向上的分裂形成4細胞T型胚體(圖2-F-G)；兩個頂細胞同時在縱軸方向上分裂(圖2-H)。繼續分裂形成6細胞、8細胞原胚，同時胚柄體積增大。在胚發育的整個過程，內珠被沒有發育，和外珠被細胞相比，內側的珠被細胞較小，由一層緊密排列的細胞組成，受精之后并逐漸退化濃縮成為一層緊密包裹胚體的超薄細胞。

授粉后110 d，多次分裂后頂細胞形成早期球形胚(圖2-I-K)。授粉后120 d，胚細胞繼續分裂，數量變多，囊腔被填充滿，此時胚柄細胞已開始裂解(圖2-L-M)。授粉后150 d，早期原胚發育為球形胚，胚柄只留下痕跡，基本完全消失(圖2-N-O)。之后，胚體積穩定，有絲分裂停止，胚細胞細胞質非常濃厚(圖2-P)。

直至授粉后180 d，金釵石斛種子成熟，胚體大有8～12細胞長，6個細胞的寬度。成熟的種子分為三部分：內種皮、外種皮、胚。隨著胚的發育，由于珠被細胞脫水皺縮，內外珠被之間形成空氣腔，一直到種子成熟，空氣腔仍沒有消失(圖2-P)。

3 結論與討論

一般有花植物的胚珠是伴隨著花的發育過程逐漸成熟的，但蘭科植物胚珠發育具有獨特的模式，即在授粉前胚珠沒有發育或僅有部分不完全發育，只有在授粉后才能啟動進一步的發育。金釵石斛雌配子發育的特點與樹蘭(Epidendrumibaguense)[5]、卡特蘭(Cattleya)[7]、無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)[7]和舌唇蘭(Platantherasusannaeil)[8]相同，在授粉前胚珠并沒有開始發育，只有在授粉后才開始發育；杓蘭類(Cypripedium)[9.10]、玉鳳蘭(Habenriagrandifloriformis)[8]、火燒蘭屬(Epipactis)[11]授粉前胚珠已經開始發育，只是不能分裂形成大孢子細胞，授粉后大孢子才能進一步發育。在植物進化史上，蘭科植物被認為是進化程度最高的，這可能是在長期的自然選擇中進化出最節省能量的方式—只有授粉后胚珠才能真正開始發育。

對不同植物而言，從花粉落到母本柱頭到受精的時間差別很大，短則幾分鐘，長則幾天數月，蘭科植物相對于其他植物從授粉到受精間隔時間較長，本研究發現，金釵石斛授粉后70 d完成受精。金釵石斛授粉前胎座未發育，授粉后胎座上有隆起發生，子房有少許膨大。說明授粉后產生了某種刺激而促使胎座發育，這種刺激有可能是人工授粉導致的，也有可能是花粉管生長過程中對子房的刺激從而產生了某些激素或某些物質，這些激素能夠調節其他營養器官的養分運輸到子房，從而促進胚珠的發育。蝴蝶蘭授粉后刺激體內產生了乙烯從而促進了胎座的發育[12]，金釵石斛的胎座發育是由上述哪種情況引起，刺激體內產生了何種物質還有待研究。

從本研究結果可見，金釵石斛雌配子和胚的發育有以下特點：子房為側膜三心皮胎座，倒生型胚珠，蓼型胚囊，授粉后70 d，受精完成，受精卵分裂形成原胚，胚的發育為石竹型。授粉后150 d，種胚發育為圓球形胚，授粉后180 d，種子成熟。金釵石斛種子內外種皮分別由胚珠時期的內外珠被發育形成，由于珠被細胞的脫水皺縮，在內珠被和外珠被之間形成空氣腔。

蘭科植物種類繁多，不同種類之間內珠被的發育存在較大差異。五唇蘭(Doritispulcherrima)[13]、古德兜蘭(Paphiopedilumgodefroyae)[14]、墨蘭(Cymbidiumsinense)[15]等在胚發育過程中內珠被退化消失，成熟時僅有外珠被發育而成的單層外種皮；在大花杓蘭(Cypripediummacranthos)[16]、臺灣杓蘭(C.formosanum)[17]、扇脈杓蘭(C.japonicum)[18]、無距蝦脊蘭[7]的研究中發現成熟種子具有內外雙層(珠被)種皮，內珠被在種子發育成熟時形成一層致密的干膜質結構緊貼于胚，并認為這是導致成熟種子萌發困難的原因，這是種子對惡劣自然環境的一種保護性適應，可以避免種子過早萌發而受到嚴酷外界條件的傷害而死亡，但在無菌播種時會成為一種障礙。在本研究中發現，成熟的金釵石斛種子也有一層由內珠被發育而成的致密干膜質結構，但金釵石斛成熟種子不存在萌發困難的現象，而且種子成熟度越高，萌發率也越高[19]，所以內珠被的存在，不應該成為判斷成熟種子是否容易萌發的依據。