百合LoNHX2基因的克隆與表達分析

王安琪，薛曉霞，左 楊，張克中，崔金騰

(北京農學院 園林學院/城鄉生態環境北京實驗室/北京市鄉村景觀規劃設計工程技術研究中心，北京 102206)

百合多數品種喜微酸性土壤，但北方地區的土壤偏堿，對百合根系造成持續鹽堿脅迫，嚴重影響種球生長和產量。目前對百合鹽脅迫的研究主要集中在生理生化特性研究，有報道0.8%～0.9%的NaCl可能是百合所承受的最大鹽脅迫濃度[1]；劉艷妮等在1%鹽濃度脅迫下對亞洲百合進行抗鹽性突變體篩選，得到抗鹽性誘變百合植株[2-3]；左志銳等比較2個百合的葉綠體和線粒體的超微結構，研究了品種'Sorbonne'和'Prato'在低鹽處理下的結構變化[4]。

轉運蛋白在營養物質攝取、代謝產物釋放以及信號轉導等廣泛的細胞活動中起著重要的作用[5]。已有研究表明植物體內存在多個與Na+轉運相關的蛋白,如液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter/exchanger,NHX)和細胞質膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白(Salt Overly Sensitive,SOS)[5]。液泡膜NHX蛋白主要行使Na+在液泡中區域化的功能，在提高植物耐鹽性方面發揮了重要作用[6]。He等將擬南芥AtNHX1轉入棉花后發現，轉基因棉花能在高濃度NaCl條件下正常生長[7]。目前，NHX2基因研究較多，已在擬南芥[8]、羽衣甘藍[9]、番茄[10]、小麥[11]、大葉藻[12]等多種植物中克隆出來，并做了進一步研究。另外，NHX基因在轉基因植物擬南芥、番茄、茄果和水稻中也證實了耐鹽性的改善[8]，但NHX基因在百合中尚少有相關研究。

百合為鹽敏感植物，土壤鹽堿化現象一直是困擾百合種植生產的重要問題，研究百合鹽脅迫機理及其耐鹽適應性，在理論和應用方面都具有重要意義。就此以OT型(東方百合與喇叭百合系間雜種)百合‘Robina’為材料，用200 mM NaCl對百合種球進行處理，分析百合LoNHX2基因在不同時間及不同部位的表達狀況，為研究百合鹽脅迫下的基因表達調控機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用OT型百合品種‘Robina’為材料，取若干種球種于北京農學院實驗基地溫室內，生長期間進行常規管理，待生長30 d后，用200 mM NaCl溶液對種植30 d的百合進行處理，分別取處理后的0、6 h、12 h、24 h的百合根系，同時，取常規培養的盛花期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖，以上材料包上錫箔紙快速放入液氮中備用。

1.2 百合RNA的提取及cDNA的合成

使用植物 RNA 快速提取試劑盒(EASYspin Plus，艾德萊)提取根系樣品的總RNA，用反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白測定儀調節cDNA模板濃度至基本一致。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.3 百合LoNHX2基因的克隆

根據課題組前期已有的百合轉錄組測序結果中的非重復序列基因unigene，查找LoNHX2基因，對LoNHX2基因的unigene進行序列比對發現5′端較完整，3′端有缺失。參照3-′RACE試劑盒(TaKaRa)操作步驟分別進行3′RACE擴增，設計3′RACE特異性引物3′GSP(GAAAAGTGGAGATTTGTCAGCA)和3′NGSP(AATCCCTATTTTCGTCGCTCAT)，并測序，通過DNAMAN軟件拼接，獲得LoNHX2基因全長cDNA。再根據最大開放閱讀框設計上游引物LoNHX2-F(ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物LoNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT)，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，用 DNA回收試劑盒(TaKaRa)進行切膠回收，用pMD19-T Vector連接轉化并測序。

1.4 百合LoNHX2基因熒光定量分析

對200 mM NaCl溶液處理0、6 h、12 h、24 h后的百合根系的LoNHX2基因進行qRT-PCR，參照LoNHX2基因全長cDNA設計上游引物LoNHX2-YGF(TTTTCCGCAACTTTATGACC)和下游引物LoNHX2-YGR(CCTATCTCCCGTGAACCTAT)，內參上游引物Loactin-F(GCATCACACCTTCTACAACG)和內參下游引物Loactin-R(GAAGAGCATAACCCTCATAGA)。利用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQ5)上進行反應。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq II(2×)12.5 μL；LoNHX2-YGF/Loactin-F 1 μL；LoNHX2-YGR/Loactin-R 1 μL；不同階段的cDNA模板1 μL；dH2O 9.5 μL。反應程序為: 95 ℃預變性2 min; 95 ℃變性10 s, 58～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40個循環。采用Loactin作為內參基因，引物為Loactin-F和Loactin-R。每個樣品生物學重復3次，技術重復3次。

1.5 百合LoNHX2基因的生物信息學分析

根據生物信息相關的數據庫信息和在線程序對百合的LoNHX2基因所編碼的氨基酸序列進行分析預測，根據預測結果分析其生物學意義。所使用的軟件和程序為： MEGA5.12、Protparam以及DNAMAN軟件；NCBI、ORFfinder、TMpred Sever、SignaIP 4.1 Server、Phytozome v12.1。

2 結果與分析

2.1 百合根系總RNA提取質量分析

對提取的百合根系總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶完整(圖1)，可用于后續試驗。

2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆

在課題組前期進行的轉錄組測序結果中已有的LoNHX2 unigene序列的基礎上，經過3’-RACE后，將目的條帶進行切膠回收、pMD19-T Vector連接轉化及菌液測序，得到1條501 bp條帶(圖2)。

2.3 百合LoNHX2基因全長cDNA的克隆結果

使用DNAMAN，將LoNHX2基因的unigene序列與3’RACE克隆序列進行拼接，得到全長cDNA序列。用在線程序ORF Finder找出LoNHX2基因的最大開放閱讀框ORF。在ORF外設計引物，進行PCR。如圖3和圖4所示，得到一條1 608 bp片段，編碼535個氨基酸。將測序結果與拼接結果在DNAMAN中比對，結果100%相似。

2.4 百合LoNHX2基因的生物信息學分析結果

通過ProtParam分析表明，百合LoNHX2基因編碼的氨基酸序列分子式為C2751H4267N677O736S28，相對分子量為59 498.92，理論等電點(PI)為7.27，不穩定系數(Instability index II)為36.67，小于閾值，表明百合LoNHX2為穩定蛋白；總平均親水性(GRAVY)為0.496，應該為脂溶性蛋白。LoNHX2由20種氨基酸組成，其中Leu(63，11.8%)、Ser(46，8.6%)、Phe(45，8.4%)、Val(44，8.2%)和Ile(40,7.5%)含量較豐富。所有氨基酸殘基中帶負電荷和正電荷的氨基酸殘基數分別為41(Asp+Glu)、41(Arg+Lys)。

TMpredServer在線預測結果(圖5)表明，該蛋白由內向外有11個跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、50～66、75～97、107～128、147～166、219～238、271～289、303～324、342～359、384～400、417～436位置上；由外向內有12個跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、51～68、76～99、111～131、148～165、170～191、218～238、268～286、303～321、338～359、382～400、416～435位置上，因此，該蛋白應是跨膜蛋白。SignaIP 4.1 Server分析表明，百合LoNHX2蛋白沒有信號肽結構。LoNHX2蛋白二級結構在線預測表明，該蛋白中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多，分別為為33.83%、31.03%，其次是無規則卷曲(Random coil)和β-轉角(Beta turn)，分別占23.18%、11.96%。

2.5 百合LoNHX2蛋白序列同源性分析結果

利用DNAMAN將LoNHX2基因序列翻譯為氨基酸序列，通過Phytozome v12.1數據庫在其他物種中的NHX2蛋白序列，進行同源性比對結果(圖6)表明，百合LoNHX2蛋白與其他物種的NHX2蛋白相似性較高，與擬南芥、水稻和玉米相似度分別為90.51%、89.42%、90.69%。

經NCBI中的CDD分析(圖7)表明，百合LoNHX2蛋白具有液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白(NHX)家族的特征，有NhaP和Na-H exchanger特異性位點，且有典型的結構域b-cpa1、NhaP2、PRK05326。

從Phytozome v12.1數據庫中，對雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘋果(Malusdomestica)、葡萄(Vitisvinifera)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、耬斗菜(Aquilegiacoeruleav)、番茄(Solanumlycopersicum)、番木瓜(Caricapapaya)、毛果楊(Popolustrichocarpa)、甜橙(Citrussinensis)、野草莓(Fragariavesca)，對單子葉植物如玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、百合(Liliumhybrids)、小葉果蕉(Musaacuminata)，對石松綱植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)，孢子植物地錢(Marchantiapolymorpha)和綠藻綱植物團藻(Volvoxcarteri)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)的全基因組進行BLAST比對，檢索LoNHX2蛋白的同源序列，利用MEGA5.2鄰接法進行系統進化樹分析(圖8)。根據進化樹可知，百合(Liliumhybrids)與小葉果蕉(Musa acuminata)聚在一個分支，可信度為100%，與單子葉植物有較近的同源關系，體現了較近的親緣關系。

2.6 百合LoNHX2基因的轉錄水平表達分析

在盛花期取百合‘Robina’的根、莖、葉、花瓣、鱗莖部位，分析LoNHX2基因在不同部位的表達量。由圖9可知，盛花期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖中均有LoNHX2基因的表達，且LoNHX2基因在花瓣中表達量最高，其次是葉片、莖、根，在鱗莖部位表達量最低。

在百合Robina種植30 d時，用200 mM NaCl對其進行鹽脅迫，在處理0、6 h、12 h、24 h時，取百合根系并提取百合根系RNA，分析各處理時期LoNHX2基因的表達量變化。由圖10可看出，在200 mM NaCl處理后，LoNHX2基因在根部的表達量呈先上升再下降趨勢。處理12 h時表達量最高，處理0時表達量最低。說明在鹽脅迫下，百合LoNHX2基因含量逐漸升高，而LoNHX2基因的積累可以降低植物細胞內Na+的濃度，防止植物受Na+毒害，由此提高百合的耐鹽性。

3 結論與討論

本研究根據轉錄組測序中已知的百合LoNHX2基因片段序列，設計3’端引物，通過巢式PCR擴增，克隆得到大小為501 bp的3’端序列。將克隆得到的3’端序列與已知序列拼接，得到LoNHX2基因全長cDNA序列，在最大開放閱讀框ORF外設計全長特異性引物，經過PCR擴增得到大小為1 608 bp的全長序列，其中包括起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，共編碼525個氨基酸。用DNAMAN軟件將其翻譯為蛋白序列后發現，百合LoNHX2蛋白的分子式為C2751H4267N677O736S28，相對分子量為59 498.92，理論等電點(PI)為7.27，該蛋白為脂溶性蛋白、穩定蛋白。LoNHX2蛋白由20種氨基酸組成，蛋白由內向外有11個跨膜螺旋，由外向內有12個跨膜螺旋，無信號肽。二級結構中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列與擬南芥、水稻、玉米相似度分別為90.51%、89.42%、90.69%。

在獐毛中，用400 mM NaCl處理6 h后，根部AINHX1基因的的表達量相對于莖部明顯升高，說明根部對鹽脅迫更敏感。在處理6 h和12 h時，根部AINHX1基因的的表達量比對照CK分別上升了6倍和8倍，處理24 h后表達量降低[13]。本試驗結果與這一致。本試驗中，在200 mM NaCl處理后，LoNHX2基因在百合根部的表達量呈先上升再下降趨勢。在處理0、3、6、12 h時表達量逐漸升高，處理24 h時表達量降低。此外，在大麥[14]、水稻[15]、灰綠狼尾草[16]中有相似的表達狀況。說明LoNHX2基因在植物鹽脅迫中有重要作用，可降低細胞質中Na+的濃度，從而降低高鹽脅迫對植物細胞的傷害。

在百合不同部位中，LoNHX2基因在花瓣中表達量最高，其次是葉片、莖、根，表達量最低的是鱗莖，說明LoNHX2基因的表達具有普遍性，在不同部位表達差異量較大。這可能與在百合盛花期時采集樣品有關，盛花期時花瓣中各細胞較為活躍、代謝旺盛，所以LoNHX2表達量較高，與此同時葉片、莖等組織部位均已處于成熟期，所以表達量較低。本研究克隆了百合LoNHX2基因序列，并分析了百合LoNHX2基因在不同時間及不同部位的表達狀況，發現了LoNHX2基因的表達規律，為研究百合鹽脅迫下的基因表達調控機理提供了理論參考。