內皮糖萼損傷對黃芪多糖調控微血管內皮細胞分泌生物活性物質的影響

張志歡，孫 雄, 2，王兆麗，王 乾，張 濤*

(1.北京農學院 動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206； 2.中牧實業股份有限公司，北京 100070)

內皮糖萼(endothelial glycocalyx)亦稱“細胞衣”或“糖衣”，是內皮細胞表面一層富含多糖的絨毛狀結構[1, 2]，由蛋白聚糖和糖蛋白構成骨架分子與細胞膜相連，骨架分子上伸出大量的寡糖鏈。內皮糖萼覆蓋于血管內皮細胞表面，具有保護內皮細胞[3]、調節血管壁的屏障和選擇性通透[4, 5]、感受血流作用力[6]等作用，尤其對微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MVECs)，其大部分功能的發揮均有內皮糖萼的參與[7]。鑒于中藥多糖與內皮糖萼在化學組成上的相似性，推測外源性中藥多糖應能有助于改善內皮糖萼的結構或功能。前期研究[8, 9]表明，黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)能顯著增加大鼠空腸黏膜MVECs糖萼的厚度，影響糖萼糖鏈的含量。MVECs的廣泛生物學功能主要在于其能夠產生多種多樣的生物活性物質，中藥多糖能夠通過調控內皮生物活性物質的產生而影響MVECs的功能，而其對內皮生物活性物質的調控與對糖萼糖鏈作用的相關性尚不清楚。為了解內皮糖萼糖鏈在中藥多糖調控MVECs分泌生物活性物質中的作用，本試驗體外分離培養大鼠空腸黏膜MVECs，以肝素酶III(heparinase III，Hep III)處理，去除部分糖萼糖鏈，然后使用APS干預，檢測一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和白介素6(interleukin 6，IL-6)分泌的變化。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

倒置熒光顯微鏡(Olympus，IX71型)，酶標儀(Thermofisher，Multiskan Ascent型)，分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司，UV-2000型)，等。

1.2 主要試劑與藥品

胎牛血清(Hyclone，貨號SH30084.03E)，DMEM培養基(Gibco，貨號H2387)，Hep III(SIGMA，貨號H8891)，IL-6 ELISA試劑盒(Abcam，貨號ab100772)，NO測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A012)，SOD測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A001)，APS(純度67%)由北京生泰爾生物科技有限公司惠贈，等。

1.3 MVECs分離培養

本試驗所用MVECs分離培養自7日齡SD大鼠空腸黏膜組織，參照相關文獻[9, 10]中的方法進行。即無菌取大鼠空腸組織，剪成約5 cm小段，縱向剖開、漂洗，刮取腸黏膜組織于0.1%膠原酶Ⅱ型溶液，剪碎，消化約60 min至無明顯組織塊，過孔徑100 μm細胞篩，濾液1 000 r/min離心5 min，沉淀用含20%胎牛血清的DMEM完全培養基重懸、接種，置于含5% CO2、37 ℃恒溫恒濕培養箱靜置孵育，2 h后洗去未貼壁細胞，更換完全培養基后繼續靜置培養至匯合狀態。胰蛋白酶消化脫壁，傳代培養，采用血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1)免疫熒光染色法進行鑒定。

1.4 細胞分組與處理

將大鼠空腸黏膜MVECs傳代于96孔板，分為對照組、APS組、Hep III組和Hep III + APS組，每組5孔。待細胞生長至亞匯合狀態后，各組更換為含2%胎牛血清的維持培養基。其中，對照組維持培養基不作處理，APS組維持培養基另含50 μg/mL APS；Hep III組在更換維持培養基前2 h，先加入終濃度為20 mU/mL Hep III預處理；Hep III + APS組在更換維持培養基前2 h先加入終濃度為20 mU/mL Hep III預處理，維持培養基中另含50 μg/mL APS。各組細胞在更換維持培養基24 h后，采取培養基上清，離心后檢測NO、IL-6的含量和SOD的活力。

1.5 細胞因子的檢測

細胞培養基上清中NO含量和SOD活力采用生化試劑盒檢測，IL-6的含量采用ELISA試劑盒檢測，操作步驟參照試劑盒說明書中進行，計算NO、IL-6的濃度和SOD的活力。

各組數據以“平均值±標準差”表示，在F檢驗(雙樣本方差檢驗)的基礎上，對各指標采用Excel軟件中“等方差t-檢驗”進行組間的統計學差異比較。

2 結 果

2.1 大鼠空腸黏膜MVECs的形態與鑒定

分離培養的大鼠空腸黏膜MVECs呈紡錘形或多邊形，大多數細胞有2個長凸起，生長至匯合狀態后呈單層，出現明顯的生長抑制，經PECAM-1免疫熒光染色鑒定顯示(圖1)，95%以上細胞呈陽性著色。細胞的傳代培養特性良好，連續傳至20余代時未見明顯形態變化。

2.2 NO分泌量的變化

對各組細胞培養基上清中NO含量的檢測結果顯示(圖2)，大鼠空腸黏膜MVECs正常情況下分泌一定量的NO；培養基中添加APS孵育后NO的含量略有增加(P>0.05)；Hep III組消化除去部分糖鏈后，培養基中NO含量與對照組比較顯著降低(P<0.05)；APS與Hep III共同處理時，MVECs的NO分泌量高于Hep III單獨處理時，而顯著性低于APS組(P<0.05)，與對照組比較，二者統計學上無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 SOD活力的變化

APS和Hep III處理對大鼠空腸黏膜MVECs產生SOD的影響與NO類似。結果顯示(圖3)，對照組細胞培養基中有一定的SOD活力；培養基中加入APS孵育后，其SOD的活力比對照組有一定程度的升高(P>0.05)；Hep III處理部分去除內皮糖萼糖鏈后，SOD的活力顯著性下降(P<0.05)；而APS和Hep III共同孵育處理MVECs時，SOD活力顯著性低于APS組(P<0.05)，而與對照組比較，統計學分析表明二者無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 IL-6分泌量的變化

檢測結果顯示(圖4)，大鼠空腸黏膜MVECs正常情況下分泌一定量的IL-6；細胞培養基中加入APS處理后，IL-6的分泌量顯著下降(P<0.05)，而Hep III處理后其分泌量顯著上升(P<0.05)；采用APS和Hep III共同孵育處理時，IL-6的分泌量較Hep III組下降，而極顯著性高于APS組(P<0.01)，與正常對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

盡管早在1966年內皮糖萼已通過電子顯微鏡被首次觀察到[11]，但直至過去十數年中才對其組成和功能逐漸了解。在以蛋白聚糖和糖蛋白等為主構成的網絡基體中，大量的內皮源性或血源性可溶性分子嵌入其中。內皮糖萼的破壞或脫落不僅影響白細胞與MVECs的黏附，也會使細胞因子等可溶性分子的合成和降解失去動態平衡，其完整性對MVECs功能的正常發揮具有重要意義。APS因其在抗氧化、抗炎和免疫調節等方面的生物學作用而被熟知和廣泛應用[12, 13]，在前期研究表明APS顯著改善內皮糖萼厚度和糖鏈含量的基礎上，本試驗進一步深入探索了APS調控內皮糖萼與內皮細胞因子分泌的相關性。結果表明，Hep III部分去除內皮糖萼，能顯著降低APS對大鼠空腸黏膜MVECs分泌NO、SOD和IL-6的作用。

內皮糖萼糖鏈不僅能夠保護MVECs免受致病因子損傷，維持其細胞因子合成功能，而且糖鏈形成的細胞表面網篩狀結構，也為大量細胞因子的停泊提供了可能，這些生物活性分子影響著其所在局部的環境，維持著局部微環境的穩定。本試驗基于APS的常見生物學作用，選擇了機體細胞功能的重要信使和效應分子NO，通過清除氧自由基對機體氧化與抗氧化平衡起著至關重要作用SOD，及對炎癥反應和免疫應答具有多效性作用的IL-6，作為評價內皮糖萼在APS調控細胞因子分泌中作用的指標。Hep III能夠特異性切割硫酸乙酰肝素類分子中GlcNS/GlcNAc(1→4)GlcA之間的鏈接鍵，常用來部分降解去除內皮糖萼的糖鏈[14]，本試驗亦選擇Hep III作為內皮糖萼糖鏈的降解酶。

當前細胞因子對內皮糖萼糖鏈影響的文獻報道較多，而有關內皮糖萼在細胞因子分泌中作用的研究文獻較少。Nikmanes等[15]研究認為，采用肝素酶破壞內皮糖萼后，內皮性一氧化氮合酶的合成受阻；本試驗使用Hep III處理后，大鼠空腸黏膜MVECs分泌NO下降，其機制是否與一氧化氮合酶的合成受阻有關尚需進一步研究。而Dekker等[16]以透明質酸酶處理內皮糖萼后發現，能夠刺激流體依賴性內皮源NO的釋放，這與本試驗使用Hep III的靜態處理結果不同，這表明內皮糖萼的降解對內皮源性NO產生的影響是多方面的，其生物學效應需要綜合分析。Ramnath等[17]研究發現，促炎細胞因子IL-6在炎癥引起游離糖萼組分升高時會進一步釋放；Huang等[18]研究也顯示，小檗堿通過減緩LPS誘導的內皮糖萼降解，能夠抑制IL-6的產生及活性氧自由基的增加，這表明破壞內皮糖萼是IL-6產生及活性氧自由基增加的原因之一。本試驗研究結果表明，Hep III處理誘導IL-6分泌增加和SOD活性下降，SOD活性的下降可能是造成活性氧自由基的重要原因，另一方面，Hep III降解部分內皮糖萼糖鏈，顯著抑制了APS對NO、SOD和IL-6的影響，這也表明內皮糖萼在APS調控大鼠空腸黏膜MVECs分泌生物活性物質中具有重要作用。

綜上所述，本試驗研究結果表明，內皮糖萼糖鏈在APS誘導大鼠空腸黏膜MVECs分泌細胞因子NO、SOD和IL-6中具有重要作用，其降解能夠顯著抑制APS對NO和SOD分泌的上調作用及對IL-6分泌的下調作用。