豬圓環病毒3型衣殼蛋白的原核表達和鑒定

李瀟南，柳迦鵬，胡 蝶，石玉佩，高 雅，周雙海

(北京農學院 動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)是一種很小的DNA病毒，豬圓環病毒3型(PCV3)則是新近發現的又一種PCV，能夠引起豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并可能引起母豬繁殖障礙[1-2]，對養豬業發展造成了一定經濟損失。目前PCV3在多個國家均有報道流行[3-4]，中國也在廣東、廣西、河北、北京等地發現PCV3的存在[5-7]，表明PCV3已在全球比較廣泛存在，是一種需要注意防控的新發傳染病病原。

PCV3全基因組大小為2 000 nt，其基因組構成與豬圓環病毒2型(PCV2)相似，都被推測存在11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，都是由ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap)[1, 8]，這是病毒唯一的結構蛋白，但2種PCV的Cap氨基酸同源性不足50%。目前，檢測PCV3主要是通過PCR方法，尚缺乏商品化的免疫學檢測試劑。因此，本研究旨在利用原核表達系統表達與鑒定PCV3-Cap融合蛋白，為PCV3的免疫學檢測方法建立打下前期基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒和主要試劑

PCV3全基因組質粒pUC-PCV3、小鼠抗PCV3-Cap血清與原核表達載體pET-32a由北京農學院動物科學技術學院動物疫病研究室制備或保存；Premix TaqTM為TaKaRa公司產品；質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒為OMEGA公司產品；大腸桿菌感受態細胞Rosetta(DE3)和His標簽包涵體蛋白純化試劑盒為北京康為世紀生物科技有限公司產品；限制性核酸內切酶EcoRⅠ、NotⅠ和T4連接酶為Thermo公司產品。

1.2 PCV3-Cap基因片段擴增

用Primer5.0軟件設計1對引物，上游引物為5′-CCGGAATTCAACGTCATATCCGTTGGA-3′，下游引物為5′-ATTGCGGCCGCTTAGAGAACGGACTTGTA-5′，擴增產物大小為507 bp。以pUC-PCV3質粒為DNA模板，上、下游引物各25 pmol來建立50 μL的PCR體系。PCR程序為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 9 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物并回收預期片段。

1.3 原核表達重組菌的構建

對回收純化后的PCR產物和pET-32a分別用EcoRⅠ 和NotⅠ 進行酶切，回收二者產物，用T4連接酶進行定向連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞Rosetta(DE3)進行增殖培養，菌液PCR鑒定后進行測序鑒定，以篩選出陽性原核表達重組菌。

1.4 表達蛋白的SDS-PAGE分析

取100 μL陽性原核表達重組菌接種到5 mL的LB培養基(含有10 g/L氨芐青霉素)，37 ℃下 160 r/min培養12 h。取3 mL菌液轉移到300 mL的LB培養基(含有10 g/L氨芐青霉素)中，37 ℃下160 r/min培養，當菌液OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度0～0.8 mol/L的IPTG誘導培養5 h。收集菌體，取一部分進行SDS-PAGE分析；另取一部分進行超聲波裂解后，分別收集上清與沉淀，再次進行SDS-PAGE分析。

1.5 Western blot檢測

純化后的目的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移到硝酸纖維素膜上，用5% BSA在室溫下封閉1 h，取出膜用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。用1∶200倍稀釋的小鼠抗PCV3-Cap血清作一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。用1∶2 000倍稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG作二抗，室溫下孵育1 h，用TBST洗液洗滌3次，每次5 min。洗滌后用HRP-DAB顯色液浸泡約1 min，出現棕色條帶后用蒸餾水洗滌以終止顯色。另設置pET-32a誘導蛋白作為對照。

2 結果與分析

2.1 原核表達質粒pET-PCV3-Cap的鑒定

以pUC-PCV3全基因組質粒為模版進行PCV3-Cap基因片段的PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后顯示有1條略大于500 bp的片段(見圖1)，與預期結果相符。回收純化PCR產物后進行重組質粒pET-PCV3-Cap的克隆與測序鑒定。對序列測定結果的BLAST比對顯示，克隆的基因片段序列與相應的PCV3-Cap基因片段序列完全一致，表明含有PCV3-Cap基因片段的原核表達質粒pET-PCV3-Cap構建成功。

2.2 目的蛋白的原核表達與可溶性分析

截短的PCV3-Cap蛋白編碼168個氨基酸，融合蛋白的分子量約為37.5 kDa。陽性重組菌誘導表達產物經SDS-PAGE后的結果(圖2)顯示，表達的融合蛋白略大于35 kDa，符合目的蛋白的預期大小，其中以0.5 mol/L的IPTG誘導培養后表達量最多。對目的蛋白的可溶性分析結果(圖2)顯示，重組蛋白在包涵體與上清中都存在，但以包涵體形式為主。

2.3 目的蛋白的純化分析

對純化前與純化后的包涵體蛋白進行SDS-PAGE，結果(圖3)顯示，純化后無可見的雜蛋白，表明純化后融合蛋白的純度高。

2.4 目的蛋白的Western blot分析

Western blot檢測結果(圖4)顯示，pET-PCV3-Cap蛋白有明顯可見的特異性條帶，而pET-32a蛋白未見特異性條帶，顯示pET-PCV3-Cap能夠與小鼠抗PCV3-Cap血清出現免疫學反應，表明目的蛋白能夠與其特異性抗體產生免疫學反應，表現出良好的免疫反應性。

3 討論

PCV3是2016年報道發現的又一種致病性豬圓環病毒，其單獨感染能夠人工復制出PDNS，且還可能引起母豬繁殖障礙等疾病[1, 9]。PCV3已在美洲、歐洲、亞洲包括中國等地逐漸散播流行[3-7]。目前對PCV3感染的檢測主要是采用PCR技術檢測病毒核酸，但用免疫學方法檢測病毒抗體也是重要方法之一，病毒抗原則是建立PCV3免疫學檢測方法的重要材料基礎。因此，本研究進行了PCV3衣殼蛋白的原核表達及鑒定。

已有關于PCV2衣殼蛋白的原核表達，多采取截短表達的策略[10]，這是由于PCV2衣殼蛋白基因的N端含有大量稀有密碼子而影響目標蛋白在大腸桿菌中的表達所致。由于PCV3與PCV2在基因組組成與結構方面非常相似，一些研究者在進行PCV3衣殼蛋白的原核表達時也是采取了截短后表達的策略。Palinski等[1]去除PCV3 衣殼蛋白基因N端105個堿基來進行原核表達，并基于表達獲得的截短蛋白建立了檢測PCV3抗體的間接ELISA方法。連凱琪等[11]去除PCV3衣殼蛋白基因N端135個堿基，通過原核表達獲得了截短的衣殼蛋白。經分析發現PCV3衣殼蛋白基因的N端同樣存在許多稀有密碼子，并且是高度堿性，非常不利于目標蛋白的原核表達，故去除其N端包含核定位序列在內的138個堿基而截短至507 nt，該段基因可編碼169 aa，相對分子量大小約為37.5 kDa。可以看出，不同研究者的表達策略大體相似，不同之處主要有兩個方面：一是截掉的堿基數量不一樣，Palinski等[1]和連凱琪等[11]分別截掉了105 nt和135 nt，而截掉了138 nt，截掉的是最多的，但只比連凱琪等[11]多截掉了3個堿基，這個影響可以忽略不計；另一個是采用的原核表達載體不同，Palinski等[1]和連凱琪等[11]使用的是pET-28a或pET-30a，而我們使用的是pET-32a。一般而言，載體分子量越大，則表達量越高。事實證明，本試驗表達獲得的蛋白含量是比較高的，這很可能與選擇使用了分子量更大的表達載體pET-32a有關。

原核表達結果顯示，比較高效地表達出了截短的PCV3衣殼蛋白，該蛋白主要以包涵體形式存在，但也有少量的可溶性蛋白。隨后的Western blot結果顯示該截短的衣殼蛋白能與小鼠抗PCV3-Cap血清進行特異性結合，說明表達獲得的目標蛋白具有良好的免疫反應性，能夠作為PCV3抗體檢測方法如ELISA中的抗原材料，為下一步進行PCV3抗體的制備及其免疫學檢測方法建立提供了材料基礎。