多肽提取物對雞生長性能和抗球蟲感染及調節(jié)免疫功能的影響

劉 丹，王 朕，王 婉，劉 杰，曹 碩，李秋明*，沈 紅*

(1.北京農(nóng)學院 動物科學技術學院，北京102206; 2.北京市朝陽區(qū)王四營地區(qū)社會保障事務所， 北京 100023；3.北京大學 口腔醫(yī)學院口腔醫(yī)療器械檢驗中心，北京100081)

雞球蟲病是集約化養(yǎng)殖中常見的且危害性極大疾病之一，防治雞球蟲病成為集約化養(yǎng)殖業(yè)中的棘手問題[1]。球蟲感染后寄生于雞消化道，不僅會降低日增重、料重比，嚴重影響生長性能，而且極易產(chǎn)生免疫應激，引起免疫器官功能障礙及免疫功能降低等[2]。目前，通常使用抗球蟲藥及疫苗來防治雞球蟲病，但疫苗預防存在安全性問題，抗球蟲藥又有耐藥性且藥物殘留給食品安全帶來影響。研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加中藥對雞球蟲病防治起到良好療效，如在日糧中添加檳榔提取物減少雞糞便卵囊排出數(shù)，緩解感染球蟲后雞盲腸結構損傷，提高機體免疫力[3]。還有研究報道將鴉膽子醇提物添加到雞日糧中有效的控制雞血便的產(chǎn)生，降低病雞盲腸的病變程度及卵囊排出量，且感染雞的體質量增重未受影響[4]。研究認為中藥中一些有效成分能夠調節(jié)機體免疫功能緩解球蟲對雞的損傷，從而起到治療雞球蟲病的效果[5]。大量研究表明，一些生物活性肽具有調節(jié)免疫的功能，如鹿茸蛋白肽可促進 RAW264.7細胞增殖，抗菌肽Api-PR19添加在飼糧中能改善雞腸道絨毛形態(tài)結構和sIgA分泌，保護盲腸免受病原微生物侵害[6,7]。古醫(yī)籍記載地鱉有破血散瘀，消腫，接骨續(xù)筋，修復骨，止血等功效，現(xiàn)代藥理研究表明地鱉有效成分具有抗腫瘤、保護心腦血管系統(tǒng)、抗氧化抗衰老、免疫調節(jié)等作用[8]。中藥大辭典中記載蠐螬可治療白血病、腫瘤、喉癌等疾病，還可破血逐疲、明目退翳。研究表明，蠐螬具有顯著的調節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和抗病毒及抗菌的功效[9]。

試驗研究利用地鱉肽和蠐螬肽的免疫調節(jié)作用，在仔雞飼料中添加地鱉肽和蠐螬肽提取物，探討多肽提取物對肉仔雞感染柔嫩艾美耳球蟲后的生長性能、抗球蟲效果和調節(jié)免疫功能的影響，目的為進一步探究中藥提取物代替獸藥在緩解家禽疾病中的應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，胎牛血清(FBS)購于法國Biowest公司，噻唑藍(MTT)、伴刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)購于美國Sigma公司，酶標板購自美國 Corning公司，細胞培養(yǎng)板、載玻片購于美國Costar公司，多聚甲醛、蘇木素、伊紅購自北京索萊寶科技有限公司，二甲苯購于北京博爾優(yōu)生物技術有限公司；鹽霉素(98%)購自廈門華生堂藥業(yè)有限公司，柔嫩艾美耳球蟲由北京農(nóng)學院寄生蟲實驗室饋贈，地鱉多肽和蠐螬多肽凍干粉由北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室提供。

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購于日本SANYO公司，潔凈工作臺購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，低溫離心機購于德國Eppendorf公司；XSZ-D2 倒置生物顯微鏡購于北京索來寶科技有限公司，Infinite 200 Pro型酶聯(lián)免疫檢測儀購于瑞士TECAN公司，脫水機包埋機RM2135 型石蠟切片機德國LEICA 公司。1日齡仔雞購自北京富佳種禽中心。

1.2 方 法

1.2.1 仔雞分組及處理 選取健康1日齡仔雞180只，隨機分為6組，每組10只，各組設3個重復。陰性對照組和陽性對照組(即球蟲感染組)仔雞飼喂基礎飼糧，鹽霉素組在基礎日糧中添加鹽霉素(60 mg/kg)，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組在基礎飼糧中分別添加地鱉肽(100 mg/kg)、蠐螬肽(100 mg/kg)、地鱉肽和蠐螬肽聯(lián)合(1∶1)。除陰性對照組外，所有14日齡仔雞感染球蟲，每只雞攻毒5×103個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，陰性對照組雞給等量體積生理鹽水。雞以籠養(yǎng)方式及玉米-豆粕型粉狀飼糧飼喂，基礎飼糧配方參照NRC(1994)和雞的飼養(yǎng)標準(NY/T 33—2004)配制，試驗期為21 d。

1.2.2 仔雞生長性能的測定 仔雞試驗前稱仔雞初始體質量，每天稱空腹仔雞體質量，分別計算仔雞平均日增質量(ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake)及料質量比(F/G)。

1.2.3 仔雞抗球蟲效果的測定 肉雞盲腸病變：取21 d仔雞盲腸，肉眼觀察盲腸病變，依據(jù)盲腸病變計分標準[10]，記錄病變值。病變值=各組平均病變計分×10。

卵囊排出數(shù)：收集仔雞感染球蟲后第4～7 天全糞，統(tǒng)計每克糞便卵囊數(shù)(OPG)。

抗球蟲指數(shù)：按照文獻[11]計算藥物抗球蟲指數(shù)(ACI)。

1.2.4 仔雞空腸腸道形態(tài)及腸道上皮內淋巴細胞數(shù)的測定 取21 d仔雞空腸中段，參照文獻[12]制作石蠟切片，測小腸絨毛高度(V)、隱窩深度(C)及二者比值(V/C)，計數(shù)每100個黏膜上皮淋巴細胞數(shù)(IEL)。

1.2.5 仔雞免疫器官指數(shù)的測定 取21 d仔雞稱質量，采血后處死剖腹剪取法氏囊、胸腺、脾臟稱質量，按公式計算：臟器指數(shù)=臟器質量/活雞體質量。

1.2.6 仔雞外周血淋巴細胞轉化率的測定 取21 d仔雞靜脈無菌采血，參照文獻[13]分離和制備外周血淋巴細胞，細胞計數(shù)后取100 μL淋巴細胞懸液和100 μL RPMI1640完全培養(yǎng)基置于96孔細胞板內培養(yǎng)，T 淋巴細胞組每孔加Con A，B 淋巴細胞組每孔加LPS，將培養(yǎng)板放置 37 ℃ 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，采用MTT法檢測淋巴細胞轉化率。

2 結 果

2.1 多肽提取物對仔雞生長性能及臟器指數(shù)的影響

試驗仔雞飼養(yǎng)至21日齡其生長性能情況見表1，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽組仔雞料重比、平均日增重和日采食量與陽性對照組相比差異均不顯著。仔雞免疫器官指數(shù)分析，結果與陰性對照組相比，陽性對照組均極顯著降低了21日齡肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；與陽性對照組相比，鹽霉素組均極顯著升高了21日齡肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；21日齡肉仔雞地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組均極顯著升高了肉仔雞臟器指數(shù)(脾臟、胸腺及法氏囊)(P<0.01)(圖1)。

表1 多肽提取物對仔雞生長性能、盲腸損傷和卵囊排出數(shù)的影響Tab.1 Effects of polypeptide extracts on the growth performance, intestinal damage and the numbers of oocyst excretion from broilers

2.2 多肽提取物對仔雞抗球蟲效果的影響

由表1知陽性對照組腸道損傷評分為3.17，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組分別為1.33、2.17、1.83、1.83，結果表明多肽提取物顯著降低感染球蟲的仔雞的腸道損傷。陽性對照組卵囊排出數(shù)達到11.95×104，而鹽霉素、地鱉肽、蠐螬和聯(lián)合肽組均低于5.76×104，結果說明多肽提取物顯著降低卵囊排出數(shù)及呈現(xiàn)一定的抗球蟲效果。陽性對照組抗球蟲指數(shù)(ACI)為126.44，鹽霉素組為179，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組分別為157.81、159.58和159.79，結果顯示多肽提取物抗球蟲效果為中效。

2.3 多肽提取物對仔雞腸道結構及腸黏膜形態(tài)的影響

仔雞腸道結構變化見圖2，與陰性對照組相比，陽性對照組腸絨毛明顯變寬變短且隱窩深度變高；鹽霉素組和多肽組與陽性對照組相比，絨毛寬度有所改善，絨毛高度基本恢復正常且絨毛深度變低。通過顯微鏡觀察及計算機分析仔雞空腸絨毛高度和隱窩深度，結果陽性對照組與陰性對照組相比仔雞空腸絨毛高度極顯著降低，隱窩深度極明顯升高，絨毛高度/隱窩深度值極顯著降低；與陽性對照組相比，鹽霉素、地鱉肽、蠐螬肽、聯(lián)合肽組仔雞空腸絨毛高度均極顯著提高，隱窩深度極顯著降低，V/C比值明顯提高(表2)。

2.4 多肽提取物對仔雞空腸淋巴細胞數(shù)及外周血淋巴細胞轉化的影響

球蟲感染仔雞的空腸上皮內淋巴細胞數(shù)量(IEL)如表2所示，陰性對照組雞腸道上皮淋巴細胞數(shù)量為11.45，陽性對照組IEL數(shù)量為13.26，地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組雞球感染蟲后IEL數(shù)分別達到22.74、21.79和24.39，比陽性對照組分別提高71%、64%和83%，且聯(lián)合肽組IEL數(shù)量增加最多。與陰性對照組相比，陽性對照組仔雞外周血B淋巴細胞轉化率差異不顯著但有降低趨勢，T淋巴細胞轉化率顯著降低；與陽性對照組相比，鹽霉素組仔雞外周血B淋巴細胞轉化率差異不顯著，但地鱉肽、蠐螬肽和聯(lián)合肽組T和B淋巴細胞轉化率均極顯著升高(表2)。

表2 多肽提取物對球蟲感染仔雞空腸腸黏膜形態(tài)、空腸上皮內淋巴細胞及外周血淋巴細胞轉化的影響Tab.2 Effect of polypeptide extracts on jejunal intestinal morphology, jejunal intraepithelial lymphocytes and theperipheral blood lymphocyte transformation of the broiler infected with chicken coccidia

3 討 論

雞球蟲病是集約化雞養(yǎng)殖業(yè)中十分嚴重的寄生蟲病，感染雞球蟲病后雞的生長性能、免疫功能及腸道屏障均會發(fā)生異常，但很多研究發(fā)現(xiàn)在日糧中添加生物活性肽可以提高雞體各項機能。有研究報道[14]在日糧中添加蚯蚓肽可以提高雞的日增重，料重比降低，這是雞生長性能的重要指標。試驗研究在日糧中添加多肽提取物仔雞的日增重、料重比影響不明顯，究其原因可能飼養(yǎng)過程中未能保證每只仔雞能吃到足夠日糧，造成個別雞采食量少，日增重緩慢，料重比受到影響。免疫器官指數(shù)和淋巴細胞轉化率可以反映免疫功能，免疫器官的指數(shù)和淋巴細胞轉化率越高，機體免疫機能會越好[15]。研究報道，日糧中添加天蠶素抗菌肽可以明顯提高817肉雜雞的免疫器官指數(shù)，顯著升高T淋巴細胞轉化率[16]。試驗本研究結果日糧中添加多肽提取物肉仔雞外周血淋巴細胞轉化率、免疫器官臟器指數(shù)明顯提高，這與前人報道一致，結果提示多肽物可提高球蟲感染仔雞的免疫調節(jié)作用。

柔嫩艾美耳球蟲病防治過程中，盲腸的損傷情況以及糞便中卵囊排出數(shù)量是檢驗防治效果的重要指標，卵囊排出數(shù)量和腸道損傷評分越低，表示藥物抗球蟲效果越佳，從而判斷出藥物的抗球蟲指數(shù)越高[5]。試驗研究中聯(lián)合肽組仔雞排出卵囊數(shù)和腸道損傷明顯低于陽性對照組(球蟲感染組)，而ACI高于球蟲感染組但低于抗球蟲藥鹽霉素組，結果表明多肽提取物有一定抗球蟲作用。雞的腸道具有消化和吸收營養(yǎng)成分及抵抗外界病原體侵害的作用，當腸道絨毛高度變低或隱窩變深時，表示腸道黏膜形態(tài)出現(xiàn)損害情況，當絨毛高度與隱窩深度之比降低時，表示腸道黏膜已受到損傷且消化吸收能力出現(xiàn)異常，嚴重時會造成動物的免疫功能下降，反之則表明腸道免疫及吸收功能完好[17]。試驗結果在日糧中添加多肽提取物后球蟲感染仔雞腸道絨毛高度增加，隱窩深度降低，絨毛高度/隱窩深度值升高，提示多肽提取物可改善球蟲感染的雞腸道形態(tài)和腸道吸收能力。

綜上所述，日糧中添加多肽提取物(地鱉肽和蠐螬肽)具有一定的抗球蟲效果，可能通過提高機體調節(jié)免疫功能降低雞球蟲感染造成的應激反應，改善腸道形態(tài)而降低腸道損傷。