葉用萵苣LsARF1的生物信息學分析及其表達

武 揚，姜尚昆，韓春暉，王婷甄，范雙喜，郝敬虹

(農業應用新技術北京市重點實驗室/北京農學院 植物科學技術學院，北京102206)

葉用萵苣成為各地生熟兼用、市場熱銷的重要葉類蔬菜。葉用萵苣喜冷涼濕潤的氣候條件，在15～20 ℃時生長最佳，超過30 ℃時則易生長不良，發生抽薹，影響食用品質，嚴重時導致減產絕收。這一問題在生菜的周年生產中亟需解決。[1，2]。

植物生長素是活性植物細胞自身分泌的一類激素，主要調控植物的生長方向，細胞的生長和分裂、組織的分化、植物器官的形成、莖的向性運動、葉的衰老脫落等，在某些植物種類中，生長素還參與誘導開花等[3]。而生長素參與調控的大多數發育過程則都是通過基因的表達來調控的[4]。在課題組前期的研究推論生長素在葉用萵苣的抽薹過程中起著重要的作用。

大多數植物中，生長素響應基因受TIR1，生長素響應因子(ARF)家族，以及AUX/IAA轉錄因子家族的調控[5]。近年來，研究表明植物生長素信號轉導可能是通過調控ARFs來實現的[6]。典型的ARF在其氨基末端具有B3 DNA結合結構域(DBD)，中間區(MR)以及羧基末端的二聚化作用結構域(CTD)[7]。CTD結構域具有III和IV結構域，與Aux/IAA蛋白類似，能夠在ARFs和Aux/IAAs之間形成同型二聚體和異型二聚體[8]。ARF家族成員眾多，不同ARF蛋白之間在功能上存在明顯差異。Sessions等發現AtARF3在擬南芥花器官的形成中起重要作用[9]。另一項研究則表明AtARF5參與胚胎模式的形成和維管組織的發育[10]。遺傳試驗表明，AtARF8是擬南芥果實發育的負調控因子，抑制其表達可誘導擬南芥單性結實[11]。SlARF4參與了番茄果實發育過程中糖代謝的調控[12]，SlARF7調控番茄果實結實和發育過程中植物生長素信號的轉導并介導植物生長素和赤霉素信號轉導[13]。在水稻胚胎組織中，OsARF1表達量顯著高于其在營養組織中的表達量，沉默OsARF1會使植株出現長勢變弱，葉片變小卷曲，不育等顯現[14]。擬南芥中，AtARF1和AtARF2均控制擬南芥葉片衰老和花器官脫落，且AtARF1是一個轉錄抑制因子[15]。

課題組在之前對高溫抽薹組和對照組的差異蛋白分析中，生長素響應因子ARF1蛋白存在顯著差異，推測其與抽薹有關。但ARF1基因在生菜中的作用機理及其與生菜抽薹的關系仍不清楚。因此進行了LsARF1基因的生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技術分析不同溫度和時間點下的表達情況，為進一步研究其在葉用萵苣抽薹中的相關作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以葉用萵苣(LactucasativaL.)易抽薹半結球型品種GB-30為試材(在農業應用新技術北京市重點實驗室進行了編號和保存)實驗于2019年9月在北京農學院日光溫室中進行。選取顆粒飽滿、大小均一的種子，常規方法催芽。將發芽情況較為整齊的種子播種于裝有基質的穴盤中，于北京農學院日光溫室中培養(光照條件為光照14 h，黑暗10 h；溫度為白天(20±2) ℃，夜間(13±2) ℃，相對濕度為65%～75%)。待幼苗生長至3葉1心時移栽至10cm口徑營養缽中。待幼苗長到6葉1心時，選取生長一致的植株移入人工氣候箱。在溫度為(20±2) ℃/(13±2) ℃(晝/夜)、光周期14 h/10 h(晝/夜)、相對濕度60%、光照強度300 μmol/(m2·s)的條件下適應2 d。之后，將幼苗分成2組：第1組幼苗一直生長在上述環境中，作為對照；第2組幼苗進行(33±2) ℃/(25±2) ℃高溫脅迫處理。在處理的0、8、16、24 d時取樣(前期研究結果表明高溫處理8 d開始抽薹)，取樣部位為花莖，每5株作為1次重復，每個樣品取樣進行3次重復。在液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉用萵苣總RNA提取與反轉錄 采用艾德萊總RNA提取試劑盒，提取葉用萵苣的總RNA。cDNA第一鏈的合成按照全式金反轉錄試劑盒提供的方法進行。

1.2.2 生物信息學分析 對蛋白質參數進行在線分析：ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)。進行信號肽分析：SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/signal p/)。NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpagenpsa_sopma.html)的自優化比對預測方法(SOPMA)預測氨基酸的二級結構。NCBI CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi公司)用于分析蛋白質的保守結構。NCBI ProteinBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)用于在線搜索LsARF1氨基酸序列的同源序列。MEME軟件用于分析保守基序。ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)用于預測蛋白質的亞細胞定位。SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)用于預測蛋白質的三級結構。MEGA7中的鄰域連接方法用于構建系統發育樹。

1.2.3 葉用萵苣ARF1基因表達分析 利用已知的擬南芥ARF1基因序列，在NCBI中的葉用萵苣全基因組庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002870075.1)中進行比對，根據基因序列設計特異性qPCR引物ARF1-F：CGCGTTGGAGTAAGGAGGCTTATG和ARF1-R：TGCATGAGAGGCAGTAGCAAGAAC。以葉用萵苣18S rRNA基因(HM047292.1)作為內參基因。使用20 μL體系與Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上檢測LsARF1基因的表達量。擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，循環數39，進行3次獨立重復試驗。

熒光定量PCR所得數據采用2-ΔΔCt法進行計算。采用統計分析軟件SPSS12.5(International Business Machine，Chicago，IL)對數據進行統計分析，Origin9(Origin Lab，Northampton，MA,USA)繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 葉用萵苣LsARF1基因序列分析

LsARF1基因編碼區的核苷酸序列長1 968 bp，共編碼656個氨基酸，LsARF1基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列如圖1所示。

利用ProtParam軟件分析LsARF1基因編碼的氨基酸序列，得出LsARF1蛋白的分子量為74 kDa，理論等電點為5.79。它的Ser，Leu和Glu水平較高，分別為10.2%，8.4%和8.2%，Cys，Trp和Tyr水平較低，分別為1.8%，1.8%和2.0%，總計84個帶負電荷的殘基(Asp+Glu)，總共66個帶正電荷的殘基(Arg+Lys)，不穩定性指數為55.4(不穩定的蛋白質)，平均親水性值為-0.53，預測為親水性蛋白質。SignalP4.0分析表明，該蛋白質不含信號肽或跨膜結構域，也不是分泌蛋白。

通過NPS@的SOPMA預測LsARF1蛋白的二級結構，發現該蛋白中α-螺旋占19.85%，387個氨基酸殘基組成無規則卷曲，含量高達59.08%，延伸鏈占16.18%，最少的是β-折疊，僅占4.89%。

2.2 葉用萵苣LsARF1保守結構域與多重序列比對分析

利用NCBI CD-esarch分析該蛋白的保守結構，發現該蛋白具有3個結構域，即B3，Auxin_resp，AUX_IAA結構域(圖2)。 B3結構域是ARF蛋白與DNA結合的區域；而Auxin_resp是ARF家族的保守結構域； AUX_IAA是ARF蛋白的二聚化結合位點。大多數ARF蛋白具有這三個結構域。根據氨基酸序列分析的結果，可以得出結論，LsARF1蛋白可能具有與ARF蛋白家族的功能。

利用DNAMAN7.0對葉用萵苣、向日葵和黃花蒿的ARF1氨基酸序列進行比對，發現LsARF1蛋白與其他物種具有高度相似性。 N-末端保守性較高，C-保守性較差，并且有更多的可變序列。(圖3)

2.3 LsARF8蛋白的生物信息學分析

進一步使用SWISS-MODEL軟件對LsARF1進行同源建模，推測ARF1蛋白的三級結構，發現它包含ARF家族特有的保守結構(圖4)。此結果與NCBI CD-search分析一致。

2.4 葉用萵苣LsARF1蛋白的系統進化分析

將獲得的LsARF1氨基酸序列與NCBI蛋白數據庫中的ARF1序列進行比對，發現它與向日葵、大豆和芝麻等10種植物的ARF1蛋白具有較高同源性。利用MEGA 7.0軟件工具構建高度同源蛋白序列的系統發育樹。這11個氨基酸序列清楚地分為二類，第一類是獼猴桃和芝麻，萵苣和刺苞菜薊為第二類。萵苣和刺苞菜薊均為菊科的農作物，同源程度較高(圖5)。

2.5 葉用萵苣LsARF1基因在高溫抽薹中的表達分析

通過qRT-PCR，檢測了葉用萵苣易抽薹品種GB-30莖部試材在高溫-常溫處理下LsARF1基因的相對表達量(圖6)。結果顯示，在處理后的8 d，高溫組和對照組中基因的相對表達量開始出現分歧，其間，對照組基因的相對表達量均高于高溫組的；高溫組基因的相對表達量呈現先下降后上升的趨勢，對照組基因的相對表達量則一直呈現上升趨勢。

綜上分析，高溫使葉用萵苣莖中LsARF1基因的相對表達量發生顯著變化。

3 討 論

近年來，隨著多個物種全基因組研究的發展，先后在擬南芥、番茄、黃瓜等植物中鑒定出ARF基因家族成員。這些進展為研究ARFs在植物生長發育過程中的作用機制以及這些因子參與信號的轉導、逆境脅迫應答等提供了堅實的基礎。Ellis等表明擬南芥ARF1在花的發育時高表達,而在其他部位含量較低,甚至不表達，表達量受外源光調節，arf1arf2突變體花藥開裂延遲[16]。Hirotaka等研究發現，MpARF1是生長素敏感轉錄因子，生長素能解除Aux/IAA介導的MpARF1轉錄活性，MpARF1突變導致地錢發生明顯的發育缺陷表型[17]。水稻中的OsARF1基因也受生長素調節，與胚芽鞘的向性有關[18]。RIN13在褐飛虱葉片中的瞬時表達可加速葉片衰老和細胞死亡，并影響ROS清除酶的活性，ARF1與RIN13相互作用，通過改變ARF1亞細胞定位來加速葉片衰老和細胞死亡[19]。ARF1對果實發育具有調控作用，如PpARF1在桃硬核期果實中有重要的調控作用[20]，VvARF1參與葡萄漿果發育[21]。在楊樹中，PdPapARF1調節促進生長和防御反應，也是不定根形成的積極刺激因子[22]。茶樹越冬芽深休眠和萌動期，CsARF1表達量較高,表明該基因與越冬芽的休眠及解除休眠密切相關[23]。

在本研究中，使用多種分析軟件對LsARF1蛋白進行生物信息學分析。通過分析，發現LsARF1蛋白具有典型的ARF蛋白家族的保守結構，并預測其在細胞核中的亞細胞定位，為研究LsARF1蛋白的功能奠定了基礎。通過對LsARF1基因在不同溫度下在易抽薹品種GB-30中基因表達水平的分析，高溫組與對照組在處理第8天開始出現差異，在處理第16天差異變得顯著，LsARF1基因表達水平由于高溫的抑制而顯著降低，高溫組葉用萵苣莖部開始出現快速生長。已有的研究可以推測，葉用萵苣發生抽薹與生長素響應因子LsARF1基因的表達被抑制有關。相信隨著研究的不斷深入，LsARF1與葉用萵苣抽薹之間的關系以及更多的抽薹相關機制將會被揭示。