ssc-miR-17-3p調控脂肪沉積的靶基因生物信息學分析

趙志顯，邢 凱*，常雪蕊，齊曉龍，盛熙暉，倪和民， 王相國，肖龍菲，王楚端，郭 勇

(1.北京農學院 動物科學技術學院，北京102206；2.中國農業大學 動物科學技術學院，北京 100193)

miRNAs是一段長18～22nt的微小的內源性非編碼RNA分子，它在轉錄后調節基因的表達。基因表達調控是通過與靶mRNAs的不完全堿基配對來完成的，導致mRNA的降解或抑制蛋白翻譯，使mRNA指導蛋白的合成受到干擾[1]。miRNAs由哺乳動物基因組的1%～5%組成，生物信息學分析顯示，超過60%的哺乳動物基因可能被單個miRNA作為靶標。細胞內和細胞外的miRNAs都被發現參與調節哺乳動物細胞或組織的基因表達。由于更廣泛的靶向能力，miRNAs還被發現參與了大多數生物過程和細胞途徑[2]。有研究表明，豬的脂肪沉積受多個miRNA和基因的調控，并通過改變與脂肪沉積相關的信號通路而發揮作用。劉玉芳等[3]研究發現，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(PPARGC1A)基因能夠負調控豬脂肪沉積過程。王穎萍[4]研究表明ssc-miR-4332、ssc-miR-4338、ssc-miR-127、ssc-miR-424為脂肪沉積過程的負調控因子, ssc-miR-194、ssc-miR-545、ssc-miR-22為豬脂肪沉積過程的促進因子。

miR-17-3p高表達于多發性骨髓瘤病人[5]和結腸癌患者[6]，在胃間質瘤[7]和尋常型銀屑病患者皮損及外周血[8]中表達下調。有研究發現[9]，miR-17-3p及其靶基因可以調控豬卵巢從卵泡期向黃體期的發育過程。miR-17-3p等組成的miR-17簇在脂肪細胞分化的克隆擴增階段顯著上調[10]。此外，miR-17-3p在3T3-L1細胞系成脂分化中發揮了作用[11]。然而，可能針對ssc-miR-17-3p轉錄并調控豬脂肪沉積的靶基因和信號通路尚無研究。因此，當前的研究旨在使用生物信息學分析方法鑒定ssc-miR-17-3p候選靶基因及調控脂肪沉積的候選靶基因，更加深入的了解microRNA對脂肪沉積的所作用的機制，為豬的育種與培育提供更有力的理論依據。

1 材料與方法

1.1 miRNAs序列相似性分析

根據NCBI中的序列，進行保守性分析，獲得miR-17-3p在各個物種的參考序列，分析各個物種與豬 miR-17-3p之間的序列相似性。miRNA在不同的哺乳動物物種中得到了廣泛的保存，因為這一特性所以能夠使用人類miRNA引物來研究與豬相同的miRNA，在軟件中進行相關候選靶基因預測。

1.2 預測miR-17-3p候選靶基因

采用miRDB(http://mirdb.org)[12]，miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)[13]和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)[14]3個在線數據庫分別對hsa-miR-17-3p進行候選靶基因預測。采用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)[15]在線軟件對上述3個數據庫預測的候選靶基因取交集。3個數據庫的共同候選靶基因與已得到的371個與豬脂肪相關的差異表達基因[16]再次取交集，從中篩選出一部分參與脂肪沉積的候選靶基因。

1.3 KEGG/GO功能富集分析和潛在調控網絡繪制

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[17]在線數據軟件獲得miR-17-3p候選靶基因參與的KEGG/GO通路，采用R語言軟件對獲得的候選靶基因進行KEGG/GO功能富集分析。

對篩選出的參與脂肪沉積的候選靶基因進行如下分析：采用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/)[18]在線數據軟件獲得候選靶基因參與的通路，然后采用Cytoscape(https://cytoscape.org/)可視化工具進行潛在調控網絡繪制。

2 結果

2.1 miRNAs序列相似性分析結果

獲得了豬及其他多個物種miR-17-3p引物序列，進行了序列相似性研究，通過分析發現，豬miR-17-3p引物序列與人和一部分嚙齒類動物序列完全一樣(表1)。

2.2 miR-17-3p候選靶基因預測與功能富集分析結果

通過預測hsa-miR-17-3p候選靶基因，在miRDB數據庫中，得到了657個候選靶基因；在miRWalk數據庫中，得到了12 986個候選靶基因；在TargetScan數據庫中，得到了5 541個候選靶基因。通過Venny取交集，得到了3個數據庫的486個共同候選靶基因。通過對486個共同候選靶基因做KEGG/GO功能富集分析，DAVID結果顯示,在KEGG通路中，候選靶基因參與了36個生物學過程，包括碳水化合物的消化吸收、胰高血糖素信號通路、催乳素信號通路和MAPK信號通路等，部分結果見圖1。在GO聚類中，候選靶基因參與了159個生物學過程，包括脂肪細胞分化的負調控、琥珀酸代謝過程、核、蛋白質結合和轉錄調控等，部分結果見圖2。

2.3 miR-17-3p潛在調控網絡

miR-17-3p是通過高通量測序在不同背膘厚度長白豬脂肪組織中發現的一個差異表達miRNA，且在背膘組中顯著高表達。在同樣的樣本中，發現了371個差異表達的基因[16]。其中13個靶基因也在差異表達基因列表中，包括TSTD2、CSDE1、SCGB1D1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF、LRRC28、UBE2D4、MAP4。在這13個重點候選靶基因中， CSDE1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF參與了脂肪代謝的過程。其中GPD2參與了脂質代謝、甘油磷脂代謝，糖醇代謝等過程；CAMK2D參與了催產素信號通路、ErbB信號通路，胰高血糖素信號通路等；HBEGF參與了GnRH信號通路，磷代謝過程，甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用等；其他基因參與了大分子代謝過程，細胞代謝過程等(圖3)。

3 討 論

在對13個重點候選靶基因做功能富集分析時，發現催產素信號通路顯著富集，有研究表明[19]，催產素(OXT)直接作用于脂肪細胞上的OXT受體，來抑制白色脂肪到米色脂肪轉變基因程序，白色脂肪細胞的褐化(也稱為米色細胞)被證明是通過消耗儲存的脂質來執行產熱作用的，這與代謝動態平衡高度相關[29]。而注射OXT可能會通過對OXT能神經元的作用而減少體內總脂肪。此外，McCormack S E等[20]在小鼠模型中發現，缺乏OXT信號的小鼠表現出胰島素敏感性降低和葡萄糖漂移增加，而缺乏OXT受體的小鼠腹部脂肪墊增厚和甘油三酯增加。對于GnRH信號通路，王作偉等[21]的GnRH主動去勢免疫公豬試驗表明，GnRH主動免疫使公豬肝臟脂肪合成能力增強，與傳統手術去勢公豬相比，脂肪合成能力降低，瘦肉率提高。Mackay J等[22]用含GnRH類似蛋白結合物的疫苗接種公豬，能夠使脂肪中不飽和脂肪酸的含量提高。促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其家族控制著各種重要的生理性過程,包括細胞的生長、分化、增殖、死亡。MAPK信號通路在脂肪細胞分化的過程中起著非常重要的作用,能直接影響脂肪因子、脂肪細胞分化基因的表達[23]。

ssc-miR-17-3p候選靶基因中，3-磷酸甘油脫氫酶(GPD2)，可以催化3-磷酸甘油酯轉化為磷酸二羥基丙酮酯。GPD2與GDP1一起構成了磷酸甘油酯穿梭反應。Kim Y H等[24]在人絨毛膜間充質干細胞成脂分化過程中的基因表達譜試驗中將GPD2作為標志基因，用于檢測脂肪細胞分化。鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIδ(CAMK2D) 的產物屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，并屬于Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶亞家族。研究發現，在肥胖大鼠中，細胞內鈣信號轉導中起重要作用的CAMK2D表達上調[25]。肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)是EGF家族中的一個肝素結合成員，被發現于人巨噬細胞培養液的中間產物中，因與肝素有很強的結合力而得名[26]。可溶性成熟的HB-EGF是由較大的膜錨定前體蛋白水解而成，對成纖維細胞、平滑肌細胞是一種有效的有絲分裂原和趨化因子[27]。Matsumoto S等[28]研究表明，HB-EGF mRNA在人脂肪組織中大量表達，肥胖小鼠脂肪組織中HB-EGF mRNA表達增加，人血漿HB-EGF水平隨脂肪堆積而升高。此外Hung C S等[29]研究表明，MBNL1自身調節參與了整個米色脂肪形成過程中MBNL1轉錄本的剪接過程。

綜上所述，ssc-miR-17-3p可能通過調控GPD2、CAMK2D、HB-EGF、MBNL1等候選靶基因，進而參與豬脂肪細胞的生成、分化和代謝，以及調控催產素信號通路、GnRH信號通路、MAPK信號通路等。通過這些發現，將有力支持ssc-miR-17-3p參與豬脂肪沉積調控機制的探索。