蛹蟲草子囊孢子單孢分離與交配型基因鑒定

李小鳳，胡渤洋，陳青君，徐詩毅，王秋穎，張國慶*

(1.北京農學院 生物與資源環境學院/農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206; 2.北京農學院 植物科學技術學院/北京林木分子設計育種高精尖創新中心/農業 應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.) Link]是子囊菌門、核菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬的模式物種。蛹蟲草是一種食藥兼用真菌，其子實體富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等，具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓等活性，媲美傳統中藥冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)[1-3]。蛹蟲草人工栽培始自20世紀80年代，經不懈努力，栽培技術成熟、操作簡單，已在全國廣泛種植[4]。而冬蟲夏草生長條件苛刻，迄今尚未大規模商業化栽培。

菌種退化是蛹蟲草人工栽培中常見的問題。隨著繼代培養，菌株活力下降、子實體產量下降甚至絕產，是制約蛹蟲草栽培的最突出問題之一。較正常菌株，退化菌株在遺傳性狀和分子水平均表現出差異，如菌絲生長速率下降、子實體異常、交配型基因偏分離、基因突變頻率升高等[5-7]。蛹蟲草菌種退化使優良性狀無法保持，給栽培產業帶來了風險。因此，解決菌種退化問題成為國內外蛹蟲草研究的重要問題之一。

交配型基因(Mating-type genes, MAT)是控制真菌有性生殖的關鍵因子。蛹蟲草是二極性異宗配合型子囊真菌，存在兩類不同源的交配型MAT1-1(MAT-alpha)和MAT1-2(MAT-HMG)，其中MAT1-1包含2個連鎖的交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2，而MAT1-2只包含一個交配型基因MAT1-2-1。單一交配型基因菌株無法形成子實體或子座上不產生子囊殼[8-10]。基因缺失和互補突變研究表明，缺失MAT1-1-1時，導致子座不育(不產生子囊殼與子囊孢子)；缺失MAT1-1-2時，雖能產生與親本相似的子座，但子囊殼敗育；缺失MAT1-2-1時，不能夠形成子座[10]。能夠出菇的蛹蟲草菌株通常含有MAT1-1和MAT1-2兩個交配型，而退化的菌株只含有MAT1-1或MAT1-2單一交配型[11]。而單交配型的子囊孢子菌株或分生孢子菌株，可通過雜交的手段，產生子實體，被認為是蛹蟲草菌種復壯和選育的重要途徑[12-14]。

本研究以能夠正常出菇的蛹蟲草CM1901菌株新鮮子實體為材料，采用單孢分離的方法獲得子囊孢子單孢菌株，并進行交配型基因鑒定，為進一步開展蛹蟲草復壯和優質高產菌株選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蛹蟲草CM1901菌株，由北京農學院植物科學技術學院食藥用菌室分離并保存。

1.2 培養基和試劑

孟加拉紅培養基，用于單孢分離培養；PDA培養基，用于單孢菌株保存。

菌絲體總DNA提取利用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.3 單孢分離與培養

單孢分離采用梯度稀釋涂布法。無菌條件下，采集無菌培養的蛹蟲草CM1901菌株新鮮成熟子座，懸掛于無菌三角瓶中過夜，待孢子充分彈射后撤去子座，以無菌去離子水充分洗滌三角瓶瓶壁，收集彈射的子囊孢子。孢子懸液以無菌去離子水梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等梯度。選取10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋液，涂布孟加拉紅平板，25 ℃避光培養2～3 d，平板上即可獲得子囊孢子萌發后剛剛肉眼可見的菌落。選擇不交叉不重疊的單孢子萌發菌落，轉接至PDA平板上繼續25 ℃避光培養，待純培養菌落直徑達到1元硬幣大小，轉入新的PDA平板培養用于交配型基因鑒定，或轉入PDA斜面培養并保存。

1.4 引物設計

根據NCBI的GenBank數據庫中的蛹蟲草交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1序列，分別設計3個交配型基因的特異性引物(表1)。

表1 PCR引物列表Tab.1 List of PCR primers

1.5 交配型基因鑒定

1.5.1 DNA提取 菌絲體總DNA提取以剛長滿平板的新鮮菌絲體為材料，使用基因組DNA提取試劑盒(天根)提取。

1.5.2 退火溫度優化 以親本菌株菌絲體總DNA為模板，設定溫度梯度優化PCR條件。PCR反應體系：基因組DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃預變性30 s，50.0～57.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個循壞，72 ℃ 10 min。PCR結束后，產物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.3 PCR擴增與測序分析 根據1.5.2優化條件，以無菌水為陰性對照、CM1901親本菌株為陽性對照，測定各單孢菌株交配型基因。分別回收親本菌株和各單孢菌株的PCR產物，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。目標序列利用NCBI在線BLAST比對分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 結果與分析

2.1 單孢分離與培養

通過梯度稀釋法，挑選出不交叉、不重疊的單孢子接種到備好的PDA培養皿中培養，最終獲得102株單孢菌株，分別編號為CMSS01-CMSS102。

2.2 退火溫度優化

采用梯度PCR確定蛹蟲草CM1901菌株親本交配型基因的最適PCR退火溫度范圍，電泳結果如圖1所示。MAT1-1-1交配型基因最適退火溫度范圍為54.3～57.0 ℃(圖1-A)，MAT1-1-2交配型基因最適退火溫度范圍為54.0～55.0 ℃(圖1-B)，MAT1-2-1交配型基因最適退火溫度為57.3 ℃(圖1-C)。單孢菌株交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1克隆時，退火溫度分別選用55.0、55.0和57.0 ℃。

2.3 親本菌株交配型基因鑒定

回收蛹蟲草CM1901親本交配型基因的清晰目標條帶PCR產物，進行測序和在線BLAST比對分析。分別獲得交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1部分序列，長度分別為422、888和785 bp，經在線BLAST比對分析，與蛹蟲草MAT1-1-1 (KP721263.1)、MAT1-1-2 (XM_006072440.1)和MAT1-2-1 (AB084257.1)相似性分別為100%、100%和98.61%。表明獲得的目標片段為蛹蟲草交配型基因。

2.4 單孢子菌株交配型基因鑒定

分別測定102株單孢分離菌株的3種交配型基因類型，部分菌株電泳圖譜如圖2所示。結果表明，102個單孢菌株根據其交配型基因類型分為3類，即僅含MAT1-1交配型、僅含MAT1-2交配型、同時含有MAT1-和MAT1-2交配型(即親本型)。僅含MAT1-1交配型菌株57株，僅含MAT1-2交配型菌株24株，另外21株為親本型，MAT1-1∶MAT1-2為78∶45(表2)。另外，這3類單孢菌株表現出不同的菌落特征(圖3)。MAT1-1交配型和親本型菌株菌落存在同心圓結構，并產黃色色素；而MAT1-2交配型菌株菌落純白，無同心圓結構和明顯色素分泌。

表2 蛹蟲草CM1901親本與子囊孢子單孢菌株交配型基因類型

3 討 論

蛹蟲草、羊肚菌等子囊真菌類食用菌普遍存在菌株退化現象，組織分離菌株隨著繼代培養菌株活性和產量下降。為解決蛹蟲草退化問題，前人從雜交育種、交配型基因等角度開展了大量研究。高新華對蛹蟲草進行子囊孢子單孢分離，并通過兩兩雜交和子實體誘導，確定蛹蟲草屬于二極性異宗配合[15]。本研究以能夠正常出草的蛹蟲草CM1901新鮮子實體為材料，采用孢子彈射和梯度稀釋培養法，獲得102株子囊孢子單孢菌株。分別測定親本和單孢菌株交配型基因MAT1-1(包括MAT1-1-1和MAT1-1-2)和MAT1-2，結果顯示親本菌株同時含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因(即親本型)，而子囊孢子菌株存在僅含MAT1-1、僅含MAT1-2和親本型3種類型。汪虹等分別鑒定了3株蛹蟲草正常出草菌株和11株不出草的退化菌株是交配型基因，3株正常菌株同時含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因，而退化的11株菌株中，1個菌株缺失MAT1-1，10個菌株缺失MAT1-2[11]。但隨著后續研究深入也發現，僅含有單一交配型的菌株也能夠形成子實體。Zheng等報道，野外采集的18個蛹蟲草菌株中，只有3個菌株同時含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因[8]。基因缺失和互補突變研究表明，當缺失MAT1-2-1時不能形成子實體，而缺失MAT1-1-1或MAT1-1-2則不產生子囊殼或者子囊殼敗育[10]。

盡管蛹蟲草是二極性異宗配合型子囊真菌，但研究顯示，無論是子囊孢子單孢菌株還是分生孢子單孢菌株，其MAT1-1和MAT1-2基因交配型比例往往達不到理論值1∶1，且不同菌株存在較大差異。譚琦等對蛹蟲草栽培親本菌株及其100株分離自菌絲的分生孢子交配型基因鑒定，親本菌株同時含有MAT1-1和MAT1-2；100株單孢菌株中，40株只含有MAT1-1、25株只含有MAT1-2，35株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為75∶60[16]。鮑大鵬從蛹蟲草CM-H07菌株分離60株分生孢子單孢菌株，其中21株只含有MAT1-1、16株只含有MAT1-2，23株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為44∶39[17]。Zheng等以同時含有MAT1-1和MAT1-2交配型的親本菌株子實體為材料，分離獲得30株子囊孢子單孢菌株，其中只含有MAT1-1和MAT1-2的菌株分別為28株和2株，親本型菌株為0，MAT1-1∶MAT1-2為28∶2[8]。另外，Zhang和Liang報道，蛹蟲草野生型和人工栽培菌株子囊孢子單孢菌株中，MAT1-1∶MAT1-2分別為66∶70和71∶60，接近理論值1∶1[12]。本研究結果中，CM1901菌株為同時含有MAT1-1和MAT1-2的親本型菌株；102個子囊孢子單孢菌株中，57株只含有MAT1-1、24株只含有MAT1-2，21株為親本型；MAT1-1∶MAT1-2為78∶45，高于Zhang和Liang報道的66∶70和71∶60[12]，但低于Zheng等報道的28∶2[8]。另外，還存在不含有MAT1-2的野生型和人工栽培菌株[8]。基于此，蛹蟲草不是典型的二極性異宗配合型子囊真菌，在不同菌株中MAT1-1∶MAT1-2比例不同，這可能是由于MAT1-2基因改變或菌株自身差異。推測，隨著蛹蟲草繼代培養，MAT1-2基因逐漸缺失，從MAT1-1∶MAT1-2理論比例1∶1直至不含MAT1-2基因。

本研究中，蛹蟲草單孢分離時，不僅僅獲得了只含MAT1-1或MAT1-2的交配型基因，同時還獲得了同時含有MAT1-1和MAT1-2的親本型菌株。高新華分別從C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9菌株子實體分離獲得9個和11個子囊孢子單孢菌株，其中各有1株為親本菌株，作者推測可能是由于將異核菌絲誤認為子囊孢子單孢菌株[15]。另一方面，譚琦、鮑大鵬等在分離分生孢子單孢菌株時，獲得了大量的親本型單孢菌株[16,17]。而周春影等報道，臺灣線蟲草(Ophiocordycepsformosana)子囊孢子單孢菌株的親本型菌株高于單一交配型，在分離獲得34株子囊孢子單孢菌株中，14株只含有MAT1-1、2株只含有MAT1-2，16株為親本型[18]。因此，在進行蛹蟲草子囊孢子或者分生孢子單孢菌株分離時，親本型單孢菌株普遍存在。類似的現象在雙孢蘑菇擔孢子中存在，一般擔子菌每個擔子頂端產生4個單核擔孢子，而雙孢蘑菇則產生2個雙核、異核擔孢子，并以此得名“雙孢”。推測在蛹蟲草子囊孢子形成過程中，有一定比例形成雙核、異核子囊孢子，從而出現親本型單孢菌株現象。這種親本型單孢菌株有待通過顯微觀察等手段進一步研究。