2型糖尿病合并OSAHS患者miR-34a、SIRT1水平的檢測及意義*

何金花，劉丹楓，高麗娟，馬紅敏

石家莊市第二醫院內分泌科，河北石家莊 050000

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是常見的呼吸系統疾病，也是糖尿病常見的并發癥[1-2]。2型糖尿病患者長期處于高糖狀態，可能會發生高糖毒性和腦細胞缺氧狀態，從而損傷呼吸中樞神經系統，導致OSAHS發生[3]。有研究顯示，敲除微小RNA-34a(miR-34a)基因可激活Notch1/低氧誘導因子-1α(HIF-1α)信號通路，減輕腦缺血再灌注對大鼠腦組織損傷和神經元凋亡的影響[4]。miR-34a可通過靶向調節沉默信息調節因子1(SIRT1)加重高糖狀態下骨髓間充質干細胞的衰老，從而促進糖尿病患者并發癥發生[5]。由此推測miR-34a及SIRT1可能與OSAHS發生相關。本研究擬探討miR-34a、SIRT1在2型糖尿病合并OSAHS患者血清中水平，以及二者單獨及聯合檢測對2型糖尿病合并OSAHS的診斷價值，旨在為2型糖尿病合并OSAHS的治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2020年3月石家莊市第二醫院收治的單純2型糖尿病患者70例(單純2型糖尿病組)，2型糖尿病合并OSAHS患者60例(2型糖尿病合并OSAHS組)為研究對象。單純2型糖尿病組男37例，女33例；年齡45～80歲，平均(61.82±9.31)歲。2型糖尿病合并OSAHS組男31例，女29例；年齡45～80歲，平均(61.98±9.45)歲。納入標準：(1)患者符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》中關于2型糖尿病的診斷標準[6]；(2)2型糖尿病患者均行Epworth嗜睡量表(ESS)初篩，ESS≥7分者行多導睡眠圖(PSG)監測，OSAHS符合2011年中華醫學會制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》診斷標準[7]；(3)臨床資料完整者。排除標準：(1)合并慢性阻塞性肺疾病及急慢性感染患者；(2)合并有內分泌疾病如甲狀腺功能減退癥、痛風等患者；(3)中樞性、混合性OSAHS患者；(4)酮癥酸中毒、乳酸酸中毒患者；(5)合并嚴重心腦血管疾病及嚴重功能障礙患者；(6)合并腫瘤患者。單純2型糖尿病組與2型糖尿病合并OSAHS組在性別、年齡上差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。患者及家屬同意簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號：R1200-100，購自北京索萊寶科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號：60906-10，購自上海信裕生物科技有限公司)；SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(貨號：KL101-969，購自上海康朗生物科技有限公司)；SIRT1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：K4923-100，購自艾美捷科技有限公司)；CFX96型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(購自德國Bio-Rad公司)；邦德安百多導睡眠監測系統[注冊號：國食藥監械(進)字2005第2212944號，購自北京杰富瑞科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1樣品采集 所有患者入院當天清晨空腹時采集靜脈血4～6 mL裝于采血管中，在4 ℃、3 500 r/min轉速下離心20 min，留取上清液，凍存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.3.2血清中miR-34a表達水平的檢測 RNA試劑盒提取血清中總RNA，以逆轉錄得到的cDNA為模板。采用qRT-PCR儀對miR-34a及內參U6進行擴增反應。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，38個循環；72 ℃ 3 min。總反應體系(10 μL)：cDNA 2 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Green PCR Kit 2 μL、ddH2O 5 μL。miR-34a正向引物5′-GGC AGT GTC TTA GCT GGT TG-3′，反向引物5′-AAG AGC TTC CGA AGT CCT GG-3′；內參U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由上海生工合成。miR-34a相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.3.3血清中SIRT1水平的檢測 采用ELISA法檢測血清中SIRT1水平，操作步驟嚴格依據SIRT1 ELISA試劑盒進行。

1.3.4臨床資料的收集 記錄患者糖尿病病程、體質量指數(BMI)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等資料。采用邦德安百多導睡眠監測系統對2型糖尿病患者每晚監測PSG，時間大于7 h，記錄患者每小時低通氣次數或呼吸暫停次數，獲得睡眠呼吸暫停低通氣指數(AHI)。

2 結 果

2.1兩組臨床指標的比較 單純2型糖尿病組、2型糖尿病合并OSAHS組的TG、TC、LDL-C、HDL-C、BMI、HbA1c水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者糖尿病病程較長(P<0.05)，FBG水平及AHI較高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者臨床指標的比較

續表1 兩組患者臨床指標的比較

2.2兩組患者血清miR-34a、SIRT1水平比較 與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者血清miR-34a表達水平較高(P<0.05)，SIRT1水平較低(P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miR-34a、SIRT1水平比較

2.32型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a與SIRT1相關性分析 miRtarBase網站預測，miR-34a與SIRT1存在結合位點；Pearson相關分析顯示，血清miR-34a表達水平與SIRT1水平呈負相關(r=-0.823，P<0.05)。

2.4血清miR-34a、SIRT1單獨及聯合檢測對2型糖尿病合并OSAHS的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，miR-34a、SIRT1水平單獨檢測診斷2型糖尿病合并OSAHS的曲線下面積(AUC)分別為0.846、0.835，靈敏度分別為65.00%、70.00%，特異度分別為88.60%、88.30%，截斷值分別為3.06、0.67 ng/mL；二者聯合檢測診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC為0.935，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%。

3 討 論

2型糖尿病與OSAHS在臨床上相互影響，2型糖尿病患者血糖控制不佳會加重OSAHS，OSAHS也可以加重胰島素抵抗，促進糖尿病發生。本研究發現，與單純2型糖尿病組相比，2型糖尿病合并OSAHS組患者糖尿病病程較長，FBG水平較高，提示2型糖尿病患者并發OSAHS可能是由于長時間血糖控制不佳導致的。此外糖尿病患者機體在應激狀態下，可發生支氣管舒縮張力異常，加重OSAHS病情[8-9]。OSAHS患者在睡眠過程中，機體可反復出現低氧與二氧化碳滯留現象，間歇性的缺氧再復氧過程，可作用于中樞交感神經調控部位，使神經發生興奮。miRNA可參與細胞的分化和調亡，從而調控基因表達的生物功能[10]。因此，探討miRNA在2型糖尿病合并OSAHS發生過程中的作用可為臨床早期治療患者提供理論依據。

miR-34家族具有進化保守性，由miR-34a、miR-34b、miR-34c組成，miR-34a位于染色體1q36.22上，是心血管疾病的重要調控因子，也可參與調控氧化應激和短暫的缺氧、復氧導致的細胞凋亡[11]。另外miR-34a的表達與高血糖誘導的血管功能障礙也有關[12]。受高糖刺激后，人視網膜微血管內皮細胞miR-34a呈高表達，且miR-34a通過改變線粒體功能參與氧化應激，從而促進視網膜微血管內皮細胞衰老[13]。miR-34a是與缺氧-復氧損傷相關的細胞死亡和細胞存活的多功能調節因子，并已報道通過靶向p53在癌細胞中誘導凋亡和細胞周期阻滯[14]。本研究發現，2型糖尿病合并OSAHS組患者血清miR-34a表達水平顯著高于單純2型糖尿病組患者，提示miR-34a可能影響2型糖尿病合并OSAHS的發生，可能原因為在高糖狀態下，miR-34a影響細胞功能，進而促進OSAHS疾病發生；也可能通過調控氧化應激和細胞凋亡從而促進2型糖尿病合并OSAHS的發生。

miR-34a是SIRT1的翻譯抑制因子[15-17]。miRtarBase網站預測，miR-34a與SIRT1存在結合位點，Pearson相關分析顯示，血清miR-34a表達水平與SIRT1水平呈負相關(r=-0.823,P<0.05)，提示miR-34a可能調控SIRT1參與糖尿病合并OSAHS的發生。LIN等[18]發現，miR-34a在2型糖尿病小鼠耳蝸毛細胞中呈高表達，并抑制SIRT1表達，高表達的miR-34a可促進2型糖尿病小鼠耳蝸毛細胞凋亡。劉金泉等[19]研究證實miR-34a低表達可通過靶向上調SIRT1抑制帕金森病模型細胞凋亡和氧化應激損傷。BADI等[20]研究發現在人主動脈平滑肌細胞中，miR-34a過度表達，且miR-34a通過下調SIRT1表達，抑制細胞增殖并誘導細胞衰老，通過血管平滑肌礦化促進血管鈣化。血管鈣化可誘導心腦血管疾病發生[21]。本研究發現2型糖尿病合并OSAHS組患者血清SIRT1水平顯著低于單純2型糖尿病組患者，提示SIRT1可能參與2型糖尿病合并OSAHS的發生。ROC曲線分析結果顯示，miR-34a、SIRT1水平單獨檢測診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC分別為0.846、0.835，二者聯合檢測診斷2型糖尿病合并OSAHS的AUC為0.935，靈敏度為87.10%，特異度為85.00%，miR-34a與SIRT1聯合檢測時靈敏度均高于二者單獨檢測時靈敏度，提示檢測患者miR-34a與SIRT1水平對臨床上診斷2型糖尿病合并OSAHS可能具有一定的參考價值。

綜上所述，2型糖尿病合并OSAHS患者血清miR-34a表達水平上調，SIRT1表達水平下調，miR-34a與SIRT1的檢測對診斷2型糖尿病合并OSAHS發生具有一定的臨床參考價值，二者聯合檢測效果可能更好。