槲皮素對痛風模型大鼠血清NETs和淋巴細胞水平的影響*

鐵 寧，李 剛，白麗杰，王 靜，趙 靜，王 勇△

1.內蒙古醫科大學附屬醫院風濕免疫科，內蒙古呼和浩特 010059；2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特 010059

痛風是一種常見的關節炎，男性發病率高于女性，且各年齡段均可能出現痛風[1]。痛風常在夜間發作，受累關節疼痛進行性加劇，呈撕裂樣、刀割樣或咬噬樣，難以忍受。關節可表現為紅腫灼熱、皮膚緊繃、觸痛明顯、功能受限，疼痛感持續幾天至幾周不等，緩慢減輕至消失[2]。發病關節會導致活動及功能受限，影響日常生活，因此，對痛風的發生、發展機制進行深入研究，并探討藥物治療的臨床療效和藥理作用機制，具有十分重要的意義[3]。有研究指出，在痛風急性發作期患者關節腔內多出現單鈉尿酸鹽晶體沉積，誘導多形核中性粒細胞聚集，且當炎癥反應加重后，產生大量活性氧，誘導中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)形成，降解趨化因子及細胞因子，抑制炎癥反應，有助于急性痛風性關節炎的恢復[4-5]。槲皮素又名櫟精，在槐樹、蘋果、茶樹、銀杏、西紅柿、丹皮等植物中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、祛痰止咳、免疫調節、神經保護及抗血栓等藥理作用[6-7]。近年來，有關槲皮素對血清NETs和淋巴細胞水平影響的報道較少。因此，本研究擬構建痛風動物模型，分析槲皮素對痛風動物模型血清NETs和淋巴細胞水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所使用的30只6周齡Wistar雄性大鼠均購自南京青龍山實驗動物繁育場，體質量180～210 g，平均(190.32±13.29)g。常規適應性飼養1周，5只1籠，分籠飼養，維持室溫22～26 ℃，濕度55%～65%，正常晝夜循環，維持12 h光照，大鼠灌胃、換水、添加飼料等均由專人進行。

1.2方法 將所有大鼠依照體質量編號，并采用隨機數表法分為3組，即對照組、模型組、槲皮素組，每組10只。模型組和槲皮素組進行造模，取仰臥位在解剖板上固定，右后肢小腿踝關節進行常規消毒，選取踝關節外側作為6號注射針穿刺點，針口和脛骨為45°夾角傾向上刺入踝關節腔內，注射250 mg/mL尿酸鈉溶液0.2 mL，踝關節對側鼓起則注射成功。對照組注入等體積的生理鹽水。造模成功后槲皮素組大鼠每天早上9：00給予200 mg/kg的槲皮素灌胃，持續給藥1周，對照組及模型組同期灌胃等體積的蒸餾水。

1.3觀察指標 給藥前和第7天給藥后依照炎癥指數評定準則[8]和Goderre功能障礙指數[9]對大鼠急性炎癥狀況進行評估，使用足容積測量儀檢測足趾腫脹度，炎癥指數分級如下：0級，正常；1級，左后足皮膚有紅斑、關節稍微腫脹；2級：左后足顯著紅腫，關節部位骨性標志消失；3級：左后足關節肢體發生腫脹。Goderre功能障礙指數分級如下：0級，步態正常，四足著地均勻；1級，輕微跛行，左后足足趾未展開，著地減輕；2級，跛行顯著，左后足趾背著地、屈起；3級：三足步態，左后足完全離地。給藥第1天和第6天眼底取血，離心收集血清，使用全自動生化分析儀分析血清中淋巴細胞水平，后取100 μL血清加入100 μL PicoGreen熒光染料，避光孵育300 s，使用熒光染色法檢測血清中游離DNA/中性粒細胞胞外誘捕網(cf-DNA/NETs)水平，采用熒光酶標儀檢測熒光值，后繪制標準曲線計算cf-DNA/NETs水平。

2 結 果

2.1模型組、槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度的比較 本研究結果顯示，采用槲皮素干預前模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度差異無統計學意義(P>0.05)；給藥后，槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度均明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 模型組和槲皮素組大鼠功能障礙指數、炎癥指數和足趾腫脹度的比較

2.23組大鼠血清中淋巴細胞水平的比較 本研究結果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中淋巴細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中淋巴細胞水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步分析發現，給藥后3組大鼠血清中淋巴細胞水平差異有統計學意義(P<0.05)，其中模型組最高，對照組最低，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠血清中淋巴細胞水平檢測結果比較

2.33組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較 本研究結果顯示，給藥前，槲皮素組和模型組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異無統計學意義(P>0.05)，但模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；進一步分析發現，給藥后3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平差異有統計學意義(P<0.05)，其中模型組最高，對照組最低，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平的比較

3 討 論

槲皮素分布廣泛，屬于黃酮醇類化合物，具有多種生物活性。有研究指出，槲皮素具有對抗自由基作用，可捕獲自由基預防脂質過氧化反應，抑制腫瘤，并還具有較強的抗炎、抗菌、預防糖尿病、抗過敏等較強的生物活性[10]。此外，槲皮素還具有輔助治療高血壓及冠心病的作用，且槲皮素毒性低，具有較大研究價值。有學者指出，采用槲皮素對痛風性關節炎模型大鼠進行干預后，具有顯著的抗氧化、抗炎活性，但其作用機制尚不清楚[11]。有研究指出，將尿酸鈉晶體注入大鼠關節腔內可用于建立急性痛風性關節炎病變模型，其臨床表現與病理表現相似[12]。采用該方案造模后關節腔內出現中性粒細胞，在滑膜和關節積液中，細胞吞噬尿酸單鈉結晶，擴大炎性反應和釋放趨化介質，同時關節滑膜肥厚和增生，關節液量增加。該造模方案快速、操作簡單、成功率高，被視為經典的急性痛風性關節炎造模方法，因此，本研究采用該方案進行造模。

痛風為慢性且復雜的炎癥反應，與機體免疫系統密切相關，其中天然免疫和適應性免疫在機體持續炎癥階段起到十分重要的主導作用。有研究指出，痛風發病初期，天然免疫激活單核細胞進入炎癥組織，將尿酸鈉晶體吞噬，促進淋巴細胞聚集，合成并分泌大量白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子[13]。本研究結果顯示，槲皮素干預7 d后，槲皮素組大鼠功能障礙、炎癥指數和足趾腫脹度均明顯低于模型組，且槲皮素組大鼠體內淋巴細胞水平顯著降低。說明槲皮素能夠顯著減輕痛風模型大鼠的關節腔內炎性反應，減少關節液容積。

人體天然免疫系統中的中性粒細胞是重要的效應細胞，在早期免疫應答階段起到十分重要的作用。有學者研究發現，中性粒細胞活化后會釋放由組蛋白和DNA構成的網狀結構，該結構被稱為NETs[14]。此外，NETs為球狀顆粒串并相互纏繞形成網狀陷阱樣結構，可限制多種病原微生物擴散，捕獲病原微生物，是中性粒細胞殺菌的新途徑。但過量NETs可誘導凝血功能障礙、內皮細胞損傷、炎癥反應，對機體產生有害作用。本研究結果顯示，模型組和槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs水平均明顯高于對照組，給藥后槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs明顯降低，且槲皮素組大鼠血清中cf-DNA/NETs低于模型組。說明采用槲皮素對痛風模型大鼠干預后可有效降低血中cf-DNA/NETs水平，進而有效下調體內炎癥反應程度[15]。

綜上所述，槲皮素干預痛風模型大鼠后可有效降低血清NETs和淋巴細胞水平。但本研究并未對基因水平的改變進行分析，有待進一步探討。