結直腸癌組織中MMP-7及TS表達與癌細胞侵襲生長的相關性*

代祥軍，吳國華

重慶大學附屬三峽醫院:1.腫瘤放療消化病區；2.腫瘤放療綜合病區，重慶 404000

結直腸癌是全球高發的消化道惡性腫瘤之一，全球每年新發直腸癌病例超過120萬，超過50%患者死亡，病死率居惡性腫瘤第3位[1]。結直腸癌惡性程度較高，易發生侵襲轉移，嚴重影響患者預后[2]。探討結直腸癌細胞侵襲行為相關機制，有助于為臨床治療和預后提供理論依據和指導。基質金屬蛋白酶7(MMP-7)是MMPs家族中參與降解細胞外基質的重要酶之一，在惡性腫瘤中通過促使細胞突破基底膜和細胞外基質限制，引發腫瘤細胞侵襲性行為的發生[3]。胸苷酸合成酶(TS)是合成胸苷酸的關鍵酶，參與腫瘤細胞DNA合成，與腫瘤浸潤、侵襲轉移、復發關系密切[4]。MMP-7、TS在結直腸癌中的報道較多，但與癌細胞侵襲生長相關的報道并不多見，本研究擬通過檢測81例結直腸癌患者組織中MMP-7、TS及癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白表達，探討MMP-7、TS與結直腸癌侵襲生長的關系，以進一步明確MMP-7、TS在結直腸癌中的生物學行為特征，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年3月重慶大學附屬三峽醫院(以下簡稱“本院”)腫瘤科收治的81例經手術切除的結直腸癌組織標本(結直腸癌組)。納入標準：(1)行結直腸癌根治手術，術后病理學證實為結直腸癌；(2)臨床資料完整；(3)年齡18歲以上。排除標準：(1)檢查前已經接受手術、放療或化療等形式治療；(2)合并其他部位腫瘤或結直腸轉移瘤；(3)妊娠或哺乳期患者。結直腸癌組中男49例，女32例；年齡53～69歲，平均(60.32±4.19)歲。另選擇同期于本院門診行腸鏡檢查的72例結腸息肉、結腸炎組織標本為對照組，均于腸鏡下取組織活檢，經HE染色排除癌變。其中男41例，女31例；年齡50～67歲，平均(61.78±4.06)歲。兩組年齡、性別構成比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得本院倫理會批準，患者及其家屬均知情同意簽署同意書。

1.2方法 取制備好的石蠟組織標本，加入二甲苯脫蠟后再用無水乙醇脫二甲苯，而后切取100 mg組織標本勻漿研磨，離心棄上清液。TRIzol(美國Sigma公司)法提取總RNA，檢測純度和完整性，取20 μg RNA標本，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉錄酶(Epicentre 公司)將RNA逆轉錄為cDNA。CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad)檢測MMP-7、TS以及癌細胞增殖蛋白[叉頭盒蛋白A1(FOXA1)、程序性細胞死亡基因4(PDCD4)、Xklp2靶蛋白(TPX2)]、侵襲相關蛋白[N-鈣黏附素(N-CD)、上皮鈣黏附素(E-CD) 、Twist相關蛋白1(TWIST1)、Yes相關蛋白(YAP)]表達。以U6 為內參，相對定量法計算MMP-7、TS，癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白在各組相對表達量，ΔΔCt目標相對表達量=ΔCt目標表達-ΔCtU6。

2 結 果

2.1結直腸癌組和對照組MMP-7、TS水平比較 結直腸癌組MMP-7、TS水平高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 結直腸癌組和對照組MMP-7、TS水平比較

2.2結直腸癌組和對照組癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白水平比較 結直腸癌組FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于對照組(P<0.05)，E-CD低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 結直腸癌組和對照組癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白水平的比較

2.3結直腸癌患者MMP-7、TS表達與癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白相關性 相關分析顯示，結直腸癌患者MMP-7、TS水平與FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相關(P<0.05)，與E-CD水平呈負相關(P<0.05)，見表3。MMP-7、TS水平之間呈正相關(r=0.642，P<0.001)。MMP-7與TWIST1、YAP水平的相關系數高于TS(Z=11.340、10.937，P<0.001)。

表3 結直腸癌患者MMP-7、TS水平與癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白的相關性分析

3 討 論

結直腸癌早期無典型癥狀，確診時多數患者處于中晚期，失去根治手術機會，預后差[5]。侵襲性是癌細胞重要生物學特性，與腫瘤轉移抑制基因、細胞外基質降解、上皮間質轉化、微環境改變、新生血管形成、細胞黏附等因素有關[6]，了解與結直腸癌腫瘤侵襲機制相關的分子機制可遏制腫瘤進展，改善患者預后。

MMP-7是具有基質降解活性和底物特異性的MMPs，發揮調控細胞生長、分化和凋亡等作用[7]。TS是在核酸代謝通路中起關鍵調節作用的限速酶，TS過度表達可促使腫瘤細胞增殖，其水平反映腫瘤細胞增殖狀態[8]。本研究結果顯示，結直腸癌患者癌組織中MMP-7、TS水平增高，提示MMP-7、TS與結直腸癌的發病機制有關。MMP-7具有廣泛的蛋白水解活性，MMP-7過表達可促使癌變，加速癌細胞增殖、浸潤和轉移[9]。TS可能通過調節p53表達影響細胞周期，促使細胞惡變，加速細胞生長增殖[10]。

在癌細胞侵襲性生長過程中，多種增殖蛋白和侵襲相關蛋白均參與其中。FOXA1通過調控G1/S細胞周期加速細胞增殖[11-12]。PDCD4可抑制G1期增殖，參與癌細胞凋亡[13]。TPX2作為一種微管相關蛋白，其異常表達可誘導細胞中心體異常擴增和惡性轉化，并促進細胞增殖，影響細胞周期和凋亡[14]。上皮間質轉化是癌細胞增殖后獲取向臨近和遠處組織轉移能力的基礎，E-CD、N-CD作為上皮間質轉化分子標志物，在惡性腫瘤中E-CD表達減少，N-CD表達增多，導致細胞間極性降低，癌細胞向鄰近組織侵襲以及向淋巴結和遠處轉移[15]。TWIST1是上皮間質轉化信號通路的關鍵轉錄因子，其高表達可促使惡性腫瘤的上皮間轉化和遠處轉移[16]。YAP通過轉錄激活凝血酶敏感素1/黏著斑激酶信號促進病灶粘連和腫瘤侵襲[17]。本研究結果顯示，結直腸癌組FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均高于對照組，E-CD水平低于對照組，說明癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白改變與結直腸癌發生有關，并驗證了結直腸癌惡性增殖和侵襲的生物學特性。

相關分析結果顯示，結直腸癌患者MMP-7、TS水平與FOXA1、PDCD4、TPX2、N-CD、TWIST1、YAP水平均呈正相關(P<0.05)，與E-CD水平呈負相關(P<0.05)，說明MMP-7、TS與結直腸癌細胞侵襲行為有關。細胞外基質降解與腫瘤侵襲行為關系密切，癌細胞通過穿透宿主細胞組織，向鄰近或遠處組織侵襲涉及細胞外基質的破壞，MMP-7作為基質降解活性較強的MMPs參與癌細胞增殖、侵襲過程[18]。GUO等[18]報道顯示MMP-7與宮頸癌盆腔淋巴結及腹主動脈旁淋巴結轉移有關。結直腸癌局部復發、腹腔盆腔內播散病灶中TS基因表達增強，腫瘤細胞DNA合成增加，導致癌細胞加速生長、增殖，引起腫瘤侵襲、播散[19]。TS過度表達上調可能導致對5氟嘧啶耐藥，從而導致腫瘤復發和盆腔內轉移[20]。進一步分析MMP-7、TS與癌細胞增殖蛋白、侵襲相關蛋白關聯程度大小，發現MMP-7與TWIST1、YAP蛋白表達相關系數高于TS，TWIST1、YAP蛋白均與癌細胞侵襲轉移有關，提示MMP-7可能在直腸癌細胞侵襲性生長過程中發揮更關鍵作用。本研究結果顯示MMP-7、TS水平也呈正相關，提示MMP-7、TS在結直腸癌侵襲行為中可能發揮協同作用。

綜上所述，結直腸癌患者癌組織中MMP-7、TS表達升高，高表達MMP-7、TS可能參與癌細胞侵襲過程。MMP-7、TS水平的檢測可為結直腸癌病情評估提供參考。