過敏性紫癜患兒血清骨橋蛋白、可溶性基質(zhì)溶素-2、維生素A、維生素D檢測的臨床意義*

趙利平，梁衛(wèi)章，劉秀珍，姜 紅，徐寶元，代寶春

河北省邯鄲市中心醫(yī)院兒科一病區(qū)，河北邯鄲 056001

過敏性紫癜(HSP)是免疫介導的全身廣泛性小血管炎、毛細血管炎癥性變態(tài)反應性疾病，好發(fā)于學齡期兒童[1]。HSP發(fā)病機制仍未完全闡明，目前已知涉及免疫異常、炎癥介質(zhì)、細胞因子、凝血/纖溶機制異常等，其中免疫功能異常是公認的HSP發(fā)病機制之一[2]，因此探討與HSP發(fā)病以及免疫功能相關的分子機制有助于指導臨床治療。骨橋蛋白(OPN)是Th1型細胞因子，通過免疫細胞相互作用增加Th1介導的免疫反應，參與多種免疫因子介導的皮膚疾病[3]。可溶性基質(zhì)溶素-2(sST2)是白細胞介素-33(IL-33)的誘騙受體，發(fā)揮免疫抑制作用[4]。維生素A(VitA)是一種具有促生長、繁殖，維持正常激素分泌的脂溶性維生素，VitA缺乏可導致抵抗力下降。25-羥維生素D3[25-(OH)D3]具有免疫調(diào)節(jié)功能，充足的VitA、25-(OH)D3有助于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定[5]。OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3是否參與HSP發(fā)病和免疫系統(tǒng)機制異常尚待探討，本研究檢測HSP患兒血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3水平，探討其與HSP患兒免疫功能和HSP發(fā)病的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年10月本院兒科收治的83例HSP患兒(HSP組)為研究對象，其中男49例，女34例；年齡3～17歲，平均(9.24±1.35)歲；單純性紫癜19例，腹型紫癜36例，關節(jié)型紫癜20例，腎型紫癜8例；病因：近1個月食物過敏史16例，藥物過敏史19例，貓狗接觸史20例，甲醛接觸史17例，幽門螺桿菌感染11例。納入標準：(1)符合中華醫(yī)學會兒科學分會免疫學組推薦的HSP診斷標準[6]；(2)近期無過敏性疾病發(fā)生；(3)住院治療，入院前未接受免疫抑制劑、抗菌藥物、維生素治療。排除標準：(1)特發(fā)性血小板減少性紫癜；(2)再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征導致的繼發(fā)性血小板減少；(3)服用藥物、風濕免疫性疾病導致的繼發(fā)性血小板減少。另選擇同期本院兒科門診接診的50例體檢健康兒童為對照組，其中男29例，女21例；年齡2～15歲，平均(9.35±1.51)歲。兩組受試者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲得本院倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人均知情同意并簽署同意書。

1.2方法

1.2.1血液標本的采集 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血10 mL(HSP組于入院24 h內(nèi)發(fā)病急性期采集，對照組體檢時采集)，分別注入促凝試管、干燥試管和抗凝試管。

1.2.2血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3的檢測 待促凝試管中的血液凝固后取上層液于離心管，置于TDZ4-WS低速自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)4 ℃、3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取血清保存于-70 ℃低溫冰箱(日本三洋電器股份有限公司)，48 h內(nèi)完成檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清OPN、sST2水平，儀器為瑞士Hamilton FAME全自動酶聯(lián)免疫分析儀，試劑盒購自美國R&D公司。采用高效液相色譜法檢測血清VitA、25-(OH)D3水平，儀器為HPLC-MS/MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Sigma公司)。

1.2.3免疫指標的檢測 干燥試管中的血液標本置于TDZ4-WS低速自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)中以4 ℃、3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取血清保存于-30 ℃低溫冰箱。采用免疫透射比濁法檢測靜脈血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM，補體C3、補體C4，試劑盒購自美國Epitope Diagnostics公司。抗凝試管中的血液標本經(jīng)EDTA抗凝后稀釋，4 ℃、3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，采用磷酸鹽緩沖液洗滌后，收集離心細胞制成外周血單個核細胞液(PBMC)懸液。調(diào)整PBMC懸液的密度至1×104個/毫升，采用FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測T淋巴細胞(CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞)水平。上述檢測均在本院檢驗中心實驗室檢測，實驗室符合《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》。

2 結 果

2.1兩組血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3水平、免疫功能指標比較 HSP組血清OPN、sST2水平高于對照組(P<0.05)，VitA、25-(OH)D3水平低于對照組(P<0.05)，HSP組補體C3、補體C4、IgA、CD4+T淋巴細胞水平低于對照組(P<0.05)，兩組IgG、IgM、CD3+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3水平、免疫功能指標的比較

組別nIgA(g/L)IgM(g/L)IgG(g/L)CD3+T淋巴細胞(%)CD4+T淋巴細胞(%)CD8+T淋巴細胞(%)HSP組831.52±0.351.46±0.6210.06±2.6559.58±6.5230.27±4.6927.42±6.59對照組502.08±0.411.62±0.7311.02±3.6461.32±6.5733.69±6.4426.37±5.73t8.3741.3471.7541.4863.5300.934P<0.0010.1800.0820.1400.0010.352

2.2HSP患兒血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3水平與免疫功能指標的相關性 HSP患兒血清OPN水平與CD4+T淋巴細胞水平呈負相關(P<0.05)，sST2水平與CD4+T淋巴細胞水平呈負相關(P<0.05)，VitA、25-(OH)D3水平與補體C3、補體C4、IgA、CD4+T淋巴細胞水平呈正相關(P<0.05)，其他指標之間均無明顯相關性(P>0.05)，見表2。

表2 HSP患兒血清OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3水平與免疫功能指標的相關性分析

2.3HSP發(fā)病的Logistic回歸分析 建立HSP發(fā)病的多因素Logistic回歸模型(因變量：1=HSP，0=無HSP)，以患兒年齡、性別、食物過敏史、藥物過敏史、貓狗接觸史、甲醛接觸史、幽門螺桿菌感染史、OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3、補體C3、補體C4、IgA、IgG、IgM、CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞為自變量，單因素分析結果顯示食物過敏史、藥物過敏史、幽門螺桿菌感染史、OPN、sST2、VitA、25-(OH)D3、補體C3、補體C4、IgA、CD4+T淋巴細胞水平與HSP發(fā)病有關(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析結果顯示OPN、sST2水平升高，CD4+T淋巴細胞、VitA、25-(OH)D3水平降低是HSP發(fā)病的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 HSP發(fā)病的單因素和多因素Logistic回歸分析

續(xù)表3 HSP發(fā)病的單因素和多因素Logistic回歸分析

3 討 論

HSP是兒童常見的血管炎性疾病，以出血性皮疹為首發(fā)癥狀，部分伴腹痛、關節(jié)炎、血尿等臨床表現(xiàn)，以免疫沉積、補體因子、中性粒細胞浸潤，伴有血管炎癥為病理特征。HSP病因尚不清楚，可能的誘因有感染、食物/花粉過敏、藥物、蚊蟲叮咬等[7]，免疫系統(tǒng)功能異常是HSP發(fā)病的主要機制之一，研究與HSP免疫機制有關的細胞因子將有助于明確HSP發(fā)病機制，指導臨床治療。

輔助性T淋巴細胞亞群Th1/Th2失衡導致的免疫異常在HSP發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用[8]。OPN是一種Th1型促炎細胞因子，可介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)間的相互作用，參與骨質(zhì)代謝、細胞遷移、炎癥基因調(diào)控，調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞分化等。OPN通過影響Th細胞分化導致Th1/Th2失衡，在Th1介導的免疫反應中扮演重要角色，參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒血清中OPN水平顯著高于對照組，提示OPN很可能參與HSP的發(fā)生發(fā)展，可能機制為OPN上調(diào)Th1細胞，促進Th1細胞因子表達，抑制Th2細胞因子表達，導致Th1/Th2免疫應答向Th1偏移，引起免疫應答紊亂，誘導腫瘤細胞壞死因子、IL-12、干擾素-γ等大量炎癥細胞因子增加，介導血管炎性反應[10]。OPN通過增加氧化應激產(chǎn)物生成和氧自由基的氧化活性，消耗抗氧化酶，過度激活氧化應激反應，加重內(nèi)皮細胞損傷和血管炎癥[11]。本研究相關性分析結果顯示，OPN與CD4+T淋巴細胞呈負相關，提示OPN參與了HSP免疫功能紊亂。OPN可影響CD4+T淋巴細胞及T淋巴細胞亞群分化，造成淋巴細胞亞群紊亂，引起體內(nèi)免疫應答紊亂，CD4+T淋巴細胞也可產(chǎn)生大量OPN，導致小血管炎癥和毛細血管炎癥的發(fā)生[12]。

ST2是IL-1受體家族成員，廣泛表達于巨噬細胞、肥大細胞、Th2細胞、心肌細胞等，sST2是ST2的可溶性形式和重要亞型之一[13]。sST2無跨膜和細胞內(nèi)結構，可釋放至細胞外入血。IL-33是IL-1家族成員，是ST2特異性配體，sST2可抑制IL-33誘導的肥大細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等產(chǎn)生Th2細胞因子和趨化因子，介導Th1型細胞過度活化。在病原體感染、損傷應激下，IL-33廣泛釋放和分泌，sST2作為IL-33誘餌受體，可競爭性地與IL-33結合，產(chǎn)生炎性反應和免疫應答[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP組血清sST2水平高于對照組，提示sST2參與了HSP發(fā)病過程，可能的機制為sST2通過IL-33/ST2信號通路介導血管炎性反應，導致HSP發(fā)病，HSP發(fā)生血管炎性反應的同時刺激巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞釋放sST2，形成惡性循環(huán)[15]。ST2與CD4+T淋巴細胞水平呈負相關，說明ST2參與了HSP免疫機制失衡過程，ST2持續(xù)升高與HSP免疫系統(tǒng)功能紊亂有關，提示IL-33/ST2軸參與了體液免疫反應過程[16]。

HSP患者免疫功能降低，VitA、維生素D可增強機體抵抗力和免疫力，在免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[17-18]。VitA具有促生長及繁殖、抗氧化、抗炎、協(xié)調(diào)免疫因子、增加抵抗力等多種生物學作用，VitA缺乏可導致上皮組織黏液分泌細胞被角蛋白生成細胞代替，破壞呼吸道、消化道、泌尿系統(tǒng)、上皮組織天然抗感染的屏障功能，降低免疫功能[18]。25-(OH)D3具有促使鈣磷吸收、皮膚細胞生長、分化以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學效應，在鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、免疫細胞、細胞因子調(diào)控方面具有顯著作用，25-(OH)D3缺乏可導致骨質(zhì)軟化、骨質(zhì)疏松、佝僂病、哮喘、貧血、胰島素抵抗等多種疾病[17]。本研究結果顯示，HSP患兒VitA、25-(OH)D3水平顯著降低，可能原因為患兒飲食攝入不足或光照不足，導致促進適應性免疫功能下降，誘導HSP發(fā)病。范麗等[19]在報道中指出HSP患兒25-(OH)D3水平越低，腎型HSP發(fā)病風險越高，住院時間越長。相關性分析顯示，VitA、25-(OH)D3與補體C3、補體C4、IgA、CD4+T淋巴細胞水平呈正相關，說明VitA、25-(OH)D3具有協(xié)調(diào)免疫因子的作用。鄒敏書等[20]發(fā)現(xiàn)補充25-(OH)D3可改善HSP患兒細胞和體液免疫功能，說明通過外源性補充25-(OH)D3可調(diào)節(jié)HSP免疫反應，提高機體抵抗力。

本研究回歸分析結果顯示OPN、sST2水平升高，CD4+T淋巴細胞、VitA、25-(OH)D3水平降低與HSP發(fā)病相關，說明過度免疫反應、免疫系統(tǒng)失衡導致的免疫功能紊亂是HSP發(fā)病的主要機制之一，OPN、sST2、CD4+T淋巴細胞、VitA、25-(OH)D3在HSP發(fā)病機制中扮演不同的角色，可能存在協(xié)同或抵抗作用，但具體機制目前尚不清楚。

綜上所述，HSP患兒血清中OPN、ST2異常升高，VitA、25-(OH)D3缺乏可加重免疫功能紊亂，OPN、ST2水平升高，VitA、25-(OH)D3水平降低是HSP發(fā)病的危險因素，或可作為臨床診斷HSP的輔助指標。