外周血miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平與急性心肌梗死患者PCI術后冠狀動脈復流情況的相關性*

張 巍，房健健，柴巧英，陳會校

河北省邯鄲市第一醫院：1.心內四科；2.重癥醫學科，河北邯鄲 056000

隨我國經濟高速發展，心血管疾病發病的危險因素普遍暴露，其發病率、病死率也隨之急劇增加，而急性心肌梗死(AMI)則為引起患者死亡的主要原因之一，因此預防和治療AMI是防治冠心病的重點[1-2]。AMI后梗死相關的血管再通、動脈血管重建，使心肌恢復有效再灌注是治療AMI的關鍵所在。經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)的主要治療手段，在臨床上得到廣泛應用和認可，約有75%的STEMI患者行PCI手術后冠狀動脈血流可恢復正常[3-4]。但是部分患者出現心肌灌注不足、冠狀動脈無復流現象，導致患者治療結果不理想，預后差。因此探討無復流現象的發生機制，對預防和治療PCI術后冠狀動脈無復流十分重要。微小RNA(miRNA)屬于非編碼單鏈RNA，與靶信使RNA(mRNA)3′端完全或部分結合使靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調控基因表達，進而參與細胞增殖、分化、凋亡等多種病理生理進程[5-6]。有研究顯示，微小RNA-34a(miR-34a)在AMI大鼠心肌細胞中高表達，能夠誘導心肌細胞凋亡[7]。沉默信息調節因子1(SIRT1)是miR-34a的靶基因之一，能夠保護細胞，減少細胞凋亡[8]。PCI術后無復流患者外周血中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平的相關報道較少，因此本研究擬測定PCI術后無復流患者外周血中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平，分析兩種標志物與冠狀動脈復流情況的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年4月本院收治的106例首次因STEMI行PCI術的患者為研究對象(STEMI患者組)，其中男61例，女45例；年齡35～79歲，平均(58.29±2.16)歲，均符合STEMI診斷標準[9]。納入標準：(1)首次發病的STEMI患者；(2)發病12 h內行PCI術；(3)胸痛≥30 min；(4)心電圖至少2個導聯ST段抬高≥2 mm；(5)肌酸激酶同工酶(CK-MB)增高兩倍以上；(6)患者資料無缺失。排除標準：(1)缺血性心肌病、陳舊性心肌梗死、左主干病變患者；(2)肝腎功能不全者；(3)多支血管疾病患者；(4)血流動力學指標異常的心律失常患者；(5)冠狀動脈嚴重扭曲病變或鈣化患者。另選取同期體檢健康志愿者124例作為對照組，其中男70例，女54例；年齡33～79歲，平均(59.09±3.72)歲。兩組受試者在年齡、性別、有無吸煙史方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經邯鄲市第一醫院倫理委員會批準，且受試者均知曉、簽訂臨床試驗知情同意書。

表1 兩組受試者一般臨床資料比較

1.2方法

1.2.1血清標本采集 清晨抽取STEMI患者PCI術后和健康志愿者體檢時空腹靜脈血6 mL，靜置20 min，待血液凝固后，置于高速離心機中，溫度25 ℃，5 000 r/min離心20 min，離心半徑15 cm，血清放入-20 ℃冰箱中待用。

1.2.2血清生化指標檢測 采用全自動生化分析儀(型號：BK-800，濟南歐萊博科學儀器有限公司)分析PCI術后血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平等生化指標。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平 采用Trizol試劑盒(批號：A7646-83，上海江萊生物科技有限公司)提取血清中總RNA，并檢測其純度；采用逆轉錄試劑盒[批號：RA639505，寶日醫生物技術(北京)有限公司]將RNA逆轉錄為cDNA。RT-qPCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司(批號：SK2491-20)。miR-34a、SIRT1 mRNA及內參U6引物序列由上海啟因生物科技有限公司合成。miR-34a的上游引物序列：5′-ATG GTT CGT GGG TGG CAG TGT CTT AGC TGG-3′；下游引物序列：5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′。SIRT1 mRNA上游引物序列：5′-GGA GGA GCT GGA TTT GGG ACT GAT-3′；下游引物序列：5′-GGT GGA ACA ATT CCT GTA CCT GCA CA-3′。內參U6上游引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游引物序列：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。相關反應在PCR擴增儀(型號：L9700C，常州德杜精密儀器有限公司)中進行。擴增條件：95 ℃ 5 min，59 ℃ 30 s，40個循環后，溶解曲線溫度61～95 ℃，讀數1次/分鐘。反應結束后，記錄PCR儀上的擴增曲線的Ct值，根據公式：2-ΔΔCt=[ΔΔCt=(Ct試驗組目的基因-Ct試驗組內參)/(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)]，分析miR-34a、SIRT1 mRNA的相對表達量。

1.3PCI術后無復流的判斷 冠心病冠狀動脈造影TIMI分級[10]：(1)無血流灌注或閉塞血管遠端無血流記為0級；(2)造影劑可以部分通過，冠狀動脈狹窄的遠端無法完全充盈記為Ⅰ級；(3)造影劑能完全充盈冠狀動脈遠端，但造影劑進入和清除的速度較正常的冠狀動脈慢記為Ⅱ級；(4)冠狀動脈遠端可以迅速充盈與消除，與正常冠狀動脈相同記為Ⅲ級。根據TIMI分級，當TIMI≤Ⅰ級時，定義為無復流，判斷時應排除冠狀動脈夾層、高度殘余狹窄或冠狀動脈痙攣、急性血栓形成。根據判斷將AMI患者進行分類，其中無復流患者44例(無復流組)，再灌注患者62例(再灌注組)。

2 結 果

2.13組受試者血清生化指標比較 與對照組相比，無復流組、再灌注組血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，無復流組顯著高于再灌注組(P<0.05)。3組血清HDL-C、BUN、Cr水平兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組受試者血清生化指標比較

2.23組受試者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平的比較 與對照組相比，無復流組、再灌注組血清miR-34a表達水平顯著升高，SIRT1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，無復流組miR-34a表達水平顯著高于再灌注組，SIRT1 mRNA表達水平顯著低于再灌注組(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平的比較

2.3PCI術后患者血清中miR-34a、SIRT1 mRNA表達水平相關性分析 Pearson相關分析結果表明，PCI術后患者血清中miR-34a和SIRT1 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.578，P<0.05)。

2.4影響PCI術后冠狀動脈無復流的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析表明，miR-34a表達水平升高、SIRT1 mRNA表達水平降低是PCI術后冠狀動脈無復流的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響PCI術后冠狀動脈無復流的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

目前PCI術后冠狀動脈無復流的病理機制主要包括：行PCI術時動脈粥樣硬化斑塊脫落活化組織因子、PCI術脫落碎片栓塞、心肌細胞內及間質水腫、微血管痙攣、白細胞聚集、微血栓形成、氧自由基介導的內皮細胞缺血損傷等[11-12]。臨床上早期診斷無復流、PCI術中置入遠端保護裝置、術前或術后輔以藥物干預等方式使PCI術后冠狀動脈無復流的防治取得了一定的成效，但STEMI患者PCI術后的微循環再灌注評價指標及預后的相關危險因素尚未明確，需要進一步研究。

AMI患者PCI術后冠狀動脈無復流現象受機體多種信號通路調控，因此研究PCI術后冠狀動脈無復流的相關調控通路，對PCI術后冠狀動脈無復流防治十分關鍵。本研究通過檢測受試者血清生化指標發現，與對照組、再灌注組相比，無復流組血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，再灌注組高于對照組(P<0.05)，說明TG、TC、LDL-C水平與PCI術后冠狀動脈無復流相關，無復流現象可能會導致TG、TC、LDL-C水平升高。miR-34a與AMI發生發展相關，研究發現，當歸補血湯能夠下調miR-34a表達水平，上調SIRT1水平，以提高小鼠左室射血分數，減少心肌細胞凋亡和纖維化，抑制心肌梗死后心室重塑[13]。另有研究發現，miR-34a表達水平在冠狀動脈粥樣硬化組至急性心肌梗死組呈逐漸升高趨勢，提示miR-34a參與冠狀動脈病變的發生發展進程，與病變程度呈正相關[14]。隨后有研究證實尿毒素硫酸吲哚酚可能通過miR-34a、NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體促進慢性腎功能不全心肌損傷[15]。本研究發現，與對照組、再灌注組相比，無復流組血清miR-34a表達水平顯著升高，再灌注組高于對照組，提示miR-34a表達水平升高可能參與PCI術后冠狀動脈無復流進程，導致無復流發生。

SIRT1主要分布在細胞核，參與細胞分化、增殖、衰老等生理過程，最新研究發現，SIRT1在調節心肌細胞凋亡進程中發揮重要作用，能量限制能夠通過AMPK信號通路上調SIRT1水平，進而保護心肌細胞免受缺血/再灌注損傷[16]。胡明珠等[17]研究發現，硫化氫(H2S)可能通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路，上調SIRT1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)水平，減小心肌梗死面積，保護大鼠缺血心肌細胞。FU等[18]研究表明，miR-34a過表達可明顯增加心肌細胞凋亡、梗死面積，左心室功能也隨之降低，進而使心肌損傷明顯加重，而miR-34a水平抑制，SIRT1受miR-34a負調控，下游基因乙酰化p53(ac-p53)、B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達也發生相應的變化，心肌損傷有所緩解，提示miR-34a抑制療法可能成為心肌缺血再灌注損傷新的治療方法。本研究發現，與對照組、再灌注組相比，無復流組血清SIRT1 mRNA表達水平顯著降低，再灌注組低于對照組(P<0.05)，提示SIRT1高表達可能有助于再灌注，緩解PCI術后冠狀動脈無復流。進一步分析發現，PCI術后患者血清中miR-34a和SIRT1 mRNA表達水平呈負相關，說明miR-34a可能通過負調控SIRT1 mRNA表達參與PCI術后冠狀動脈無復流。多因素Logistic回歸分析表明，miR-34a表達水平升高、SIRT1 mRNA表達水平降低是PCI術后冠狀動脈無復流的危險因素，提示miR-34a高表達、SIRT1低表達可能導致無復流發生，這類患者需要特別重視。

綜上所述，在PCI術后冠狀動脈無復流患者血清中，miR-34a高表達、SIRT1低表達可能誘導無復流發生，但是具體調控機制還有待深入研究。