異甘草素對結直腸癌細胞的體內外抑制作用研究*

唐 越，李欣雨，彭鈺凌，賀吉春，李秋香，伍怡穎

成都醫學院藥學院，四川成都 610000

結直腸癌是消化道常見惡性腫瘤，其發病率在癌癥中位于前4位[1-3]。結直腸癌早期不容易被發現，患者確診時已錯過手術治療最佳時間，同時，該病具有較高的復發及轉移率[4-5]，因此大多數患者需要接受傳統放化療改善預后[6]。但化學治療藥物的不良反應較多，而天然藥物具有多種優勢，例如毒性小、靶點多等[7]。

異甘草素(ISL)主要來源于植物甘草，具有增強免疫功能、減輕炎癥等作用[8-10]。近來在卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤的相關研究中發現，ISL有較好的抗腫瘤作用[11-12]。但其對結直腸癌的作用及抗癌機制還不清楚。因此，本研究擬從體內外兩方面探討ISL對結直腸癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 人結直腸癌細胞株HCT-116、SW480和小鼠結直腸癌細胞株CT26購自中國科學院上海生物科學研究所細胞庫；ISL購自美倫生物科技有限公司；溴化噻唑藍四氮唑(MTT)購自碧云天生物有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物技術發展有限公司。

1.2方法

1.2.1MTT法測定ISL對HCT-116、SW480細胞體外增殖的影響 將HCT-116、SW480細胞以1×104個/孔鋪于96孔板。待貼壁后，HCT-116細胞分別加入梯度濃度的ISL(10、20、40、60、80、100 μmol/L)，同樣SW480細胞中也加入梯度濃度的ISL(20、60、100、140、180、220 μmol/L)，對照組細胞不經藥物處理。24 h后，每孔分別加入10 μL MTT，4 h后，加二甲基亞砜(DMSO)，于酶標儀490 nm波長處檢測光密度值。

1.2.2流式細胞術檢測ISL對HCT-116、SW480細胞凋亡的影響 將HCT-116、SW480細胞以2×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL處理24 h，按說明書收集細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(PI)染色，于流式細胞儀檢測。

1.2.3流式細胞術檢測ISL對HCT-116、SW480細胞周期的影響 將HCT-116、SW480細胞以2×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL(20、40、60、80 μmol/L)處理24 h，按說明書收集固定細胞，PI染色，于流式細胞儀檢測。

1.2.4劃痕實驗分析ISL對HCT-116、SW480細胞遷移力的影響 將HCT-116、SW480細胞以5×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL進行干預。用10 μL移液槍頭在孔板內底部輕劃3～5條等距平行線，顯微鏡下拍照初始劃痕距離。待ISL作用24、48、72 h后，分次取出6孔板，顯微鏡下拍照、觀察。

1.2.5復制CT-26荷瘤小鼠模型觀察ISL對小鼠移植瘤生長的影響 將CT26細胞制成濃度為1×107個/毫升的細胞懸液。取雄性BALB/C小鼠，于右側腋下注射CT26細胞，每只100 μL，復制小鼠結直腸癌移植瘤模型。當小鼠腋下腫瘤生長到40～50 mm3時，將體質量和腫瘤大小較一致的小鼠選出，共18只，隨機分為ISL低濃度組、ISL高濃度組和陰性對照組，每組6只。并按分組給藥，低濃度組腹腔注射ISL 30 mg/(kg·d)，高濃度組腹腔注射ISL 60 mg/(kg·d)，陰性對照組腹腔注射蒸餾水100 μL/[(10 g)·d]。每天記錄小鼠的體質量和腋下腫瘤體積。10 d后，處死全部小鼠，剝取腫瘤并稱取質量。采用4%的多聚甲醛固定瘤塊，常規脫水、石蠟包埋、切片、染色、顯微鏡下拍照、觀察。

2 結 果

2.1ISL在體外對結直腸癌細胞增殖情況的影響 MTT法檢測結果顯示，結直腸癌細胞增殖率隨ISL濃度的升高而顯著降低(P<0.01)。ISL濃度為20、40、60、80、100 μmol/L時，HCT-116細胞增殖抑制率分別為(11.05±2.84)%、(27.94±6.69)%、(50.64±5.68)%、(56.25±4.24)%、(70.65±3.86)%。SW480細胞在ISL濃度為60、100、140、180、220 μmol/L時的細胞增殖抑制率分別為(34.25±1.79)%、(40.63±1.44)%、(50.11±3.15)%、(81.50±1.06)%、(58.62±3.25)%。結果表明ISL可呈濃度依賴性的抑制結直腸癌細胞體外增殖。

2.2ISL對結直腸癌細胞凋亡情況的影響 在ISL干預24 h后，HCT-116細胞及SW480細胞凋亡率較對照組明顯升高(P<0.01)。HCT-116細胞在80 μmol/L的ISL作用后，總凋亡率為(72.22±5.48)%。SW480細胞在180 μmol/L的ISL作用后，總凋亡率為(62.23±0.86)%。結果表明，ISL呈濃度依賴性促使人結直腸癌細胞發生凋亡。

2.3ISL對結直腸癌細胞周期的影響 經ISL干預24 h后，HCT-116和SW480細胞中G1/G0期細胞比例降低(P<0.01),S期細胞比例增加(P<0.05)。結果表明，ISL可以將結直腸癌細胞阻滯在S期，從而抑制細胞生長。見圖1。

注：A為不同濃度的ISL干預HCT-116細胞后，細胞在各周期中的分布情況；B為不同濃度的ISL干預SW480細胞后，細胞在各周期中的分布情況；與ISL濃度為0 μmol/L時比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4ISL對結直腸癌細胞遷移力的影響 對照組的細胞劃痕隨著時間逐漸變窄，細胞向中間遷移。而經ISL處理后細胞遷移距離較短，劃痕間隙較大。結果表明，ISL可顯著抑制HCT-116和SW480細胞的遷移。見圖2。

注：A為ISL對HCT-116細胞遷移力的影響，B為ISL對SW480細胞遷移力的影響。

2.5ISL對小鼠結直腸癌移植瘤生長的影響 ISL干預后小鼠結直腸癌移植瘤生長緩慢，腫瘤體積較小(P<0.05)，質量減輕(P<0.05)。ISL低濃度組和高濃度組的抑瘤率分別為(22.89±5.09)%和(30.99±3.34)%。HE染色結果顯示，ISL高濃度組腫瘤組織壞死區較大，細胞核溶解，細胞輪廓顯示不清，血管輪廓被破壞，而陰性對照組中腫瘤細胞分布緊密，未見大片壞死區域。見圖3。

注：A為小鼠腫瘤質量在不同濃度ISL作用下的變化；與陰性對照組比較，*P<0.05。B為采用HE染色觀察小鼠移植瘤的組織病理改變。

3 討 論

ISL是從草本類豆科植物甘草中所提取，已發現有器官保護、調節免疫、減輕炎癥等作用，屬黃酮類化合物[10]。隨著對ISL功能活性研究的深入，發現ISL對乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤表現出抗癌潛力。其可通過促使腫瘤細胞凋亡、引發自噬、阻滯細胞周期及抑制新生血管形成等途徑，延緩腫瘤的生長及轉移[11]。

如在宮頸癌細胞中，ISL可通過內質網應激途徑，引發HeLa細胞凋亡[13]。ISL還能通過降低人乳頭瘤病毒(HPV)16 E6、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的蛋白表達水平，同時上調Bax的表達，從而發揮抑制宮頸癌細胞生長的作用[14]。ISL可通過降低乳腺癌PI3K/Akt及NF-kappa B等信號通路的活性，進而抑制乳腺癌腫瘤的生長、轉移[15]。在前列腺癌中，ISL可阻滯細胞周期，引發細胞凋亡，降低細胞增殖力，其抗前列腺癌作用可能與活性氧(ROS)水平降低有關[16-18]。

近年來，隨著對ISL研究的深入，部分學者發現其在結直腸癌的抗腫瘤活性中具有一定作用，體外研究顯示，ISL可抑制結直腸癌細胞HCT-116、SW620細胞增殖及侵襲[19]。給小鼠用ISL灌胃能有效抑制由AOM/DSS誘導的結腸癌的發生[7]。但目前有關ISL抗結直腸癌的作用研究還較少，且缺少體內移植瘤的實驗研究。

當受到外界干擾或基因調控異常時，細胞周期進程以及增殖失去控制，進而導致腫瘤的形成。因此，阻滯腫瘤細胞周期進程，抑制其增殖或誘發凋亡，均可有效延緩腫瘤的生長和惡性發展，同時也是評估抗腫瘤藥物效果的重要指標。本研究首先通過MTT法檢測HCT-116、SW480細胞在梯度濃度ISL作用后的增殖變化，結果顯示，隨著ISL濃度增加，細胞增殖率明顯下降(P<0.05)，表明ISL能抑制結直腸癌細胞的體外增殖，并呈濃度依賴性。同時利用流式細胞術檢測ISL對結直腸癌細胞凋亡及周期的影響發現，ISL干預后細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，與細胞增殖實驗結果一致。高濃度ISL作用后S期細胞比例增加(P<0.01)，提示ISL具有細胞周期阻滯作用，可將細胞阻滯在S期，從而抑制結直腸癌細胞生長。

結直腸癌為易轉移性癌，而癌癥轉移主要取決于癌細胞的遷移、侵襲能力。因此本研究采用劃痕實驗檢測了ISL對結直腸癌細胞遷移力的影響。結果顯示，ISL明顯抑制HCT-116及SW480細胞向劃痕間隙移動，降低細胞的遷移力。

此外，為進一步明確ISL的體內抗結直腸癌作用，本研究還復制了CT-26結直腸癌荷瘤小鼠模型。結果發現，ISL能明顯抑制小鼠移植瘤生長，殺傷腫瘤細胞。

綜上所述，本研究表明ISL可促使結直腸癌細胞發生凋亡，細胞周期于S期阻滯以及細胞遷移力下降，并可抑制結直腸癌細胞的體外增殖及小鼠體內移植瘤生長。提示ISL將可能成為結直腸癌的潛在治療藥物，但其抗結直腸癌作用分子機制尚不清楚，需進一步研究。