癲癇小兒認知功能與血清蛋白激酶C 表達水平的相關性分析

王葆輝 耿麗娟 劉 俊

開封市兒童醫院，河南 開封475000

癲癇是一種神經系統常見病，由已知或未知病因引起，以腦部神經元高度同步化，伴自限性異常放電為特征［1-3］。小兒由于神經系統發育不完善，容易因外傷或不明原因而誘發癲癇。流行病學資料顯示，我國0～14 歲人群癲癇的患病率約0.345%［4］，癲癇的反復發作造成神經細胞受損，長期的癇性放電可引起大腦結構功能以及突觸可塑性的改變，致患者的認知、情感、行為等功能異常［5-6］，但目前癲癇的治療效果不盡如人意，易遷延不愈發展為慢性難治性癲癇，影響患兒終生，故尋找新的可行途徑尤為重要。

蛋白激酶C（protein kinase，PKC）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族［7］，根據序列同源性和輔因子可將其分為3個亞組。經典的PKC亞組需要結合鈣和二酰基甘油（DAG）才能激活，并包含同工型PKC α、-βⅠ和-βⅡ（或由同一基因剪接）和-γ［8］。相反，新型PKC 亞組的成員（-δ、-ε、-η和-θ亞型）僅需要DAG 即可激活，而非典型PKC（-ι和-ζ異構體）則獨立于鈣和DAG 激活，但取決于獨特的基于脂質的介質和蛋白質-蛋白質相互作用。PKC 在機體中廣泛分布，可以催化多種蛋白質如膜蛋白、酶蛋白等，使底物上的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化發揮生物學效應［9］。活化的PKC對多種外部或自身剌激導致的細胞凋亡均有促進作用，海馬神經元的凋亡是癲癇后認知能力受損的原因之一［10］，突觸后PKC的作用底物神經顆粒素（neurogranin，NG）通過鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等參與學習記憶的構建［11］。因此，探尋癲癇后認知能力的改變與PKC表達水平的相關性對小兒癲癇后認知改變具有一定的現實意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018-01—2019-10 就診于開封市兒童醫院的10～15 歲癲癇患兒79 例（癲癇組），同時征詢正常發育同齡兒童40例為對照組。對照組男28 例，女12 例，年齡（11.23±1.45）歲；癲癇組男57例，女22 例，年齡（10.11±1.21）歲。2 組性別（χ2=0.380，P=0.592）、年齡（t=1.137，P=0.227）比較無明顯差異（P＞0.05）。癲癇組患兒的診斷參照小兒癲癇診斷標準［12］，各組兒童納入試驗前均征求家屬意見，并簽署知情同意書。排除標準：合并凝血功能障礙者；合并嚴重感染性疾病者；合并惡性腫瘤者；合并先天性心臟病者；存在麻醉藥物過敏史者；表達障礙或精神疾病者。

1.2 方法

1.2.1 認知功能評估量表（mini-mental state examination，MMSE）測試：2 組兒童均于靜室中30 min 內獨立自主完成量表，從定向力（orientation）、記憶 力（memory）、注 意 力 和 計 算 力（attention &calculate）、回憶能力（recall）以及語言能力（language）5 個維度檢測各組兒童的認知功能。若遇不理解量表內容兒童，可在不干預自主答題的前提下予以解釋，量表總分為0～30分。

1.2.2 血清PKC水平測定：抽取2組靜脈血2 mL，使用人蛋白激酶C ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，F16527），抽取的血液樣本3 000 r/min 離心10 min，汲取上清液，1∶2稀釋（取50 μL，加標本稀釋液50 μL），按照說明進行標準品配制：加入1 mL蒸餾水于標準品原液中，混勻，使標準品濃度為20 ng/mL。標準管共設8 管，首先在第1 管中加標本稀釋液900 μL，其余管中加入500 μL，而后在第1管中加入配置好的濃度20 ng/mL的標準品溶液100 μL，混勻，使用移液器吸出500 μL，移入第2 管中。反復上述操作進行稀釋，至第7 管時從中吸出500 μL 棄去。第8管不加樣作為空白對照。ddH2O 1∶10倍稀釋10×標本稀釋液，同時用ddH2O 1∶20 稀釋洗滌液。96 孔抗體包被酶標板中每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，充分震蕩混勻，置37 ℃溫箱孵育120 min。棄去各孔溶液，加入洗滌液洗板4～6次，反扣于濾紙上控干液體。各孔加入一抗工作液100 μL，充分混勻，置37 ℃溫箱孵育60 min。洗板，每孔加酶標二抗工作液100 μL，37 ℃溫育30 min。洗板，各孔加入100 μL底物工作液，37 ℃避光孵育15 min后每孔加入100 μL終止液混勻終止反應。30 min內將酶標板置于酶標儀中，在450 nm處檢測吸光值。所有OD值都應減除空白值后再行計算。以標準品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/mL 為橫坐標，OD 值為縱坐標，畫出標準曲線。根據樣品OD 值在該曲線圖上查出相應PKC含量，再乘以稀釋倍數。

1.3 統計學分析 應用SPSS 23.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行t檢驗，單因素方差分析用于多組間比較，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 認知功能評估結果 2組定向力、注意力和計算力及語言能力比較差異無統計學意義（P＞0.05），癲癇組記憶能力、回憶能力及總評分較對照組均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01，圖1）。

2.2 血清PKC 檢測結果 與對照組相比，癲癇組患兒血清PKC 水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2）。

圖1 MMSE檢測結果Figure 1 Results of the MMSE test

2.3 認知評估結果與PKC 表達水平的相關性 相關性分析顯示，定向力評分結果與PKC 水平略呈負相關，差異無統計學意義（P＞0.05）；記憶力評分與PKC水平呈正相關，差異有統計學意義（P＜0.000 1）；注意力和計算能力評分與PKC 水平呈正相關，差異有統計學意義（P=0.004 4）；回憶能力與PKC 水平呈正相關，且具有顯著的相關性（P＜0.000 1）；語言能力與PKC水平呈正相關，相關性不顯著；MMSE總評分與PKC 水平呈正相關，且具有顯著相關性（P＜0.000 1，圖3）。

圖2 2組血清PKC檢測結果Figure 2 Serum PKC test results of two groups

3 討論

作為一種慢性中樞神經系統疾病，癲癇具有突發性、短暫性、反復發作性和刻板性的特點，表現為運動、感覺、意識、精神、行為和自主神經等不同障礙［13-14］。相關研究表明，約60%的癲癇患者于兒童時期首次發病，患病率高達5.5%，屬于兒童時期最常見的慢性病［15］。研究表明，與其他慢性病（如糖尿病或哮喘）兒童相比，癲癇兒童對疾病的了解甚少［16］。最重要的是，癲癇兒童日常生活也受到嚴重影響，不僅在學校，而且在愛好、與其他兒童的互動和交友方面也是如此［17-18］。此外，文獻報道癲癇兒童的社交技能比無癲癇的兒童差［19］。因此，有必要特別關注患有癲癇的兒童和青少年。究其原因，在此時期小兒各系統的發育均未成熟，神經系統尤為明顯。癇性放電容易造成智力、認知發育畸形，且會持續至成人時期，給患兒帶來終生性的損害［20-21］。

圖3 MMSE評分與PKC水平的相關性分析 A：定向力與PKC的相關性；B：記憶力與PKC的相關性；C：注意力和計算能力與PKC的相關性；D：回憶能力與PKC的相關性；E：語言能力與PKC的相關性；F：總評分與PKC的相關性Figure 3 Correlation analysis of MMSE scale score and PKC level. A: Correlation between orientation and PKC; B:Correlation between memory and PKC; C: Correlation between attention and computing ability and PKC; D: Correlation between recall ability and PKC;E:Correlation between language ability and PKC;F:Correlation between total score and PKC

顳葉癲癇是最常見的局灶性癲癇，占局灶性癲癇發作的36%［22-23］。在顳葉癲癇中，大腦的癲癇發作始于處理情緒和短期記憶的顳葉。既往研究表明，認知障礙和記憶力減退是顳葉癲癇的常見共病［24-26］，但顳葉癲癇相關認知功能障礙的分子機制仍不清楚［27］。研究表明，轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白在記憶形成以及許多神經退行性疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病和血管性癡呆）的發病機制中發揮關鍵作用［28-29］。cAMP 反應元件結合蛋白在大腦的神經元可塑性和長期記憶形成中的作用已有文獻記載，且其對于空間記憶的形成是不可或缺的［30］。此外，cAMP 反應元件結合蛋白還調節基因的轉錄，包括腦源性神經營養因子、Arc 和c-fos，介導了短期和長期記憶的形成［31］。氧化損傷產生的ROS產物是炎癥反應、小膠質細胞激活和炎性細胞因子釋放的關鍵觸發因素，這些反應抑制了神經發生，抑制了腦源性神經營養因子的表達，導致神經元可塑性降低和記憶形成［32］。研究表明，氧化應激在此過程中可明顯降低線粒體功能、誘導神經元死亡而促進癲癇發作，導致認知障礙［33］；此外，突觸可塑性的改變與相關轉運蛋白的異常表達會導致因自由基積聚而引起神經元受損［34-36］，同時也增加了神經元興奮性，從而導致異常放電及認知障礙［37-38］。相對于成人癲癇后認知障礙，小兒癲癇患者因處于神經系統的發育階段而對正常的學習記憶能力甚至智力發育造成不可逆的影響，因此，需要特別關注小兒癲癇后的認知損傷。為了探尋小兒癲癇后認知損傷的可能干預靶點，首先需要了解患兒的認知狀態，綜合考慮小兒的受教育程度特點，本研究采用認知狀態量表對患兒認知狀態進行評估。

MMSE量表于1975年為應用于阿爾茨海默病而編制，簡單易行，經過多年臨床應用，已成為最廣泛的認知功能評估方法之一［39］。MMSE 量表主要包括記憶力、注意力、定向力及語言能力、回憶能力、計算能力等五方面共計30條目的評估，滿分為30分。國內對于腦卒中患者行MMSE 的相關應用表明，其結果具有良好的信度，總體內部一致性（Cronbach’s α系數）為0.833，可作為認知功能快速檢測方法［40］。

蛋白激酶是一類將蛋白固定位點與磷酸根偶聯以激活蛋白活性的生物酶家族，PKC是其中的一種，為一組由單一肽鏈結構組成的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶［41］。PKC 廣泛分布于哺乳動物及人類的各組織中，腦中含量尤為豐富［42］。相關研究表明，PKC參與調節細胞增殖分化、神經發生等過程，在突觸可塑性調節及學習與認知行為中起關鍵作用［43］。研究表明，PKC 家族的同工酶PKC-ε的活化在阿爾茲海默病的發展中起保護作用［44］；另外，PKC-γ在大腦中的表達主要參與調節神經可塑性，包括長時程增強（long-term potentiation，LTP）和 長 時 程 抑 制（long-term depression，LTP）的調節［45］。

本研究表明，癲癇患兒與正常患兒相比，認知能力明顯受損，記憶能力與回憶能力受損尤為明顯，同時癲癇患兒的血清PKC 水平也明顯降低，兩者存在一定的關聯性。研究證實，PKC 的兩種非典型亞基PKCι/λ和PKMζ在長時程增強和記憶維持中發揮不同作用，且PKMζ作用更為顯著［46］，PKMζ可以通過與維持LTP相同的機制維持長時呈記憶［47］。通過主動位置的回避或放射迷宮的空間調節等操作可以誘導海馬PKMζ表達的持續增加，并可以持續1 d～1 個月；另外，向海馬區注射PKMζ反義寡核苷酸能夠抑制PKMζ的表達增加，阻止長時呈記憶形成［48］。在抑郁大鼠模型可觀察到空間學習記憶功能下降和PKC表達水平的降低，同時應用帕羅西汀治療后可使大鼠的空間學習記憶功能恢復，PKC 表達水平也隨之升高［49］。此外，PKC 的激動劑苔蘚抑素-1 可以中斷大鼠腦缺血缺氧所引發的細胞凋亡，增加存活細胞數量，同時也可誘導海馬CA1 區的突觸發生以及增加腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達。進一步的研究表明，PKC 介導的突觸重塑和修復過程一致，這一現像可以在腦缺血缺氧事件發生后維持大鼠持久的空間學習和記憶保留［50-51］。本研究MMSE 評分與PKC 表達水平的Pearson 相關性分析表明，癲癇兒童MMSE 量表的總體評分、記憶能力評分、注意力與計算能力評分及回憶能力評分與PKC 水平具有明顯的相關性，若以PKC 及其家族衍生物作為小兒癲癇治療新的切入點，或可發現新的治療靶點。