杜氏肌營養不良癥的研究進展

陶原 田春梅

濱州醫學院附屬醫院兒科，山東 256600

杜氏肌營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性的X染色體隱性遺傳病，由營養不良蛋白基因突變導致營養不良蛋白缺乏［1-2］。在兒童早期發病，其特征是近端肌肉無力和小腿肥大。患者通常在12歲喪失下肢行動能力，并在十幾歲至二十多歲時死于心肺并發癥［3］。目前尚沒有特效藥物，且發病機制研究不明確，本綜述描述了DMD的臨床特征，臨床表現和治療方法，以及一些新型療法的研究。

1 發病機制

DMD是由DMD基因突變引起的。DMD基因編碼肌營養不良蛋白，位于肌細胞膜和肌動蛋白絲表面之間的肌細胞內，其mRNA主要在骨骼、心臟、平滑肌和大腦中表達［4］。該基因可發生各種突變，如缺失（60%～65%）、重復（5%～10%）和點突變［5］。DMD基因突變的影響主要取決于變異是否破壞了這些突變下游的閱讀框。在框外突變的情況下，DMD基因的開放閱讀框被破壞從而導致DMD。同時，框內突變并形成異常但保留部分功能的肌營養不良蛋白則引起貝克肌營養不良癥［6］。由于突變類型的不同，骨密度表型可能有很大的變化，從無癥狀到邊緣性DMD［6］。有研究表明，LTBP4和SPP1基因多態性的表達對患兒發病年齡有影響［7］。肌營養不良蛋白是連接肌動蛋白細胞骨架和細胞外基質的蛋白質復合物的一部分，有助于支持肌肉的力量和功能。缺乏肌營養不良蛋白會導致肌肉纖維中肌漿蛋白的丟失和肌肉的廣泛損傷，從而導致肌肉退化。此外，DMD肌纖維逐漸被脂肪和纖維化組織所取代，這進一步阻礙了肌肉的機械和生理活動［8］。

肌營養不良蛋白缺乏導致肌肉纖維變性的確切機制仍不清楚。質膜上肌營養不良蛋白的缺乏會導致肌營養不良蛋白相關蛋白從膜上脫離，導致細胞骨架破裂，從而導致膜的不穩定性和對機械應力的敏感性增加。涉及肌肉損傷的各種機制包括機械損傷、細胞內鈣水平增加、信號分子的損傷和免疫細胞的增加等［9］。

2 臨床表現

DMD患者通常從近端開始出現進行性肌無力。典型表現為肌肉無力、步態改變、肌肉假性肥大和行走困難。患有DMD的男孩通常在沒有用糖皮質激素治療的前提下在10～12歲之間失去行走能力，隨著病情的發展，許多患者由于缺乏椎旁肌肉支持而發展為脊柱側凸，從而影響呼吸，上肢功能在后一階段下降。其他骨科并發癥包括長骨骨折、骨質疏松及關節攣縮癥（通常首先出現在腳踝，然后出現在臀部、膝蓋、肘部和腕部）。也有認知障礙、注意力缺陷多動障礙、自閉癥譜系障礙和強迫癥的報道。擴張型心肌病通常在10歲以后出現，隨著年齡的增長，DMD患者呼吸和心臟問題繼續惡化，最終導致其死亡［10］。

3 治 療

3.1 糖皮質激素 迄今為止，皮質類固醇（如潑尼松龍、潑尼松）已成為唯一在DMD中有效的藥物。皮質類固醇改善DMD強度的具體機制尚不清楚，但目前包括改變肌肉纖維中基因的調節、減慢骨骼肌分解速度、減少細胞毒性T細胞、降低胞質鈣濃度和增加成肌細胞修復。有研究結果表明，潑尼松龍、潑尼松可以在10 d內改善肌肉力量，3個月藥效達最大，并可以維持18個月，且可降低呼吸系統與心臟功能及脊柱側彎患病率和嚴重性。但還沒有長期的隨機對照試驗表明，皮質類固醇會延長DMD患者失去活動能力的時間或改善長期生存率。其不良反應包括體質量增加、行為改變、免疫抑制和多毛癥，少部分可出現骨折、青春期延遲、高血壓、白內障及生長抑制［11-12］。

3.2 上調肌營養不良蛋白相關蛋白 Utrophin蛋白是6號染色體編碼的常染色體同源物，與肌營養不良蛋白在結構和功能上高度相似［13］。在mdx小鼠（DMD模型）和金毛獵犬MD（一種DMD的狗模型）中，utrophin蛋白的上調已顯示出有效的結果［14］。有研究表明，ezutromid使用utrophin A啟動子片段在預防mdx小鼠的進展過程中具有積極作用，并減少了再生纖維的數量［15］，但有一項臨床2期試驗表明其缺乏持續療效［16］。目前正在開發第2代內啡肽調節劑，特別是SMT022357被發現在mdx小鼠中表現出體內有效性，導致骨骼肌和心肌中肌營養因子的表達增加。目前已有研究表明，相對于ezutromid，SMT022357更能有效改善mdx小鼠的營養不良表型［17］。

3.3 核因子抑制劑 核因子κB（NF-κB）的激活可以導致肌肉蛋白降解，從而產生促炎性介質，如細胞因子和趨化因子，導致疾病發展。DMD患者可見到活化的NF-κB。edasalonexent（CAT-1004）是一種口服小分子，設計為抑制NF-κB，目前處于1/2期臨床試驗中。該藥物處于臨床試驗第一階段，該藥物被證明對DMD患者安全且耐受良好，但是有報道稱在治療12周后，未能顯示出明顯獲益［19］。在一項為期1周的針對男孩的1期試驗中的第一階段，也耐受性良好，目前需要下一步試驗［18］。

脂聯素也可以降低NF-κB的活性，對暴露于急性和慢性炎癥的骨骼肌具有抗炎作用。之前在一項mdx小鼠的實驗中證明了脂聯素基因的局部給藥降低了骨骼肌中幾種氧化應激及炎性標志物的表達，并增加了肌源性標志物的表達，可以延緩疾病進展，通過減少肌肉發炎、損傷來改善肌肉及力量［20］。

3.4 肌肉生長抑制素抑制劑 肌肉生長抑制素（myostatin）是轉化生長因子-β超家族的成員，是骨骼肌質量的負調控因子。mdx小鼠模型中肌生成抑制素的丟失或抑制可導致肌肉質量增加、力量增強、脂肪替代減少和纖維化。domagzumab與myostatin結合并抑制其活性，在實驗中顯示安全且耐受性良好，但近期一項2期臨床試驗未取得良好結果［21］。ACE-031是激活蛋白IIB型和IgG1-Fc的融合蛋白，結合肌生長抑制素和相關配體，在一項臨床實驗中由于其肌肉相關的不良事件最終導致終止研究［22］。胰島素生長因子1有助于肌肉生長，目前正在臨床試驗中研究其在增加肌肉纖維大小方面的用途。

3.5 基因治療

3.5.1 外顯子跳躍 通常是指使用合成反義寡核苷酸抑制剪接增強子位點，以防止特定外顯子參與剪接。從而將DMD轉化為貝克肌營養不良癥，其目的是閱讀框的恢復以及部分功能性肌營養不良蛋白的產生，而不是非功能性肌營養不良蛋白的產生［23］。13%～14%的DMD患者有可能通過跳過第51外顯子糾正閱讀框的缺失。eteplirsen可與肌營養不良蛋白前體mRNA的外顯子51結合，并在mRNA加工過程中導致外顯子51被跳躍。它是美國食品藥品監督管理局批準的首個跳過外顯子的藥物（2016年9月），一項meta分析表明eteplirsen還可以改善患者呼吸功能，但尚無長期證據表明他們的長期療效［24］。drisapersen和suvodirsen也已在臨床試驗中進行過評估，但由于的risapersen的不良反應（蛋白尿及血小板減少）及suvodirsen（肌營養不良蛋白并未增加）效果不佳，其臨床開發已停止。針對第53外顯子，golodirsen治療的患者的肌肉活檢顯示，外顯子53跳躍增加，有肌營養不良蛋白的產生［25］。viltolarsen也顯示安全且有療效，但仍需要進一步研究［26］。對于外顯子45跳躍，casimersen的療效也正有一項臨床試驗進行研究［27］。

3.5.2 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD患者基因組中插入外源DMD基因，從而表達出有作用的肌營養不良蛋白。由于肌營養不良蛋白基因的分子量大和病毒載體相對攜帶較少，需要創建微型肌營養不良蛋白基因進行傳遞。重組腺相關病毒載體用于攜帶微量和小型營養蛋白。這種療法在mdx小鼠中顯示出成功的結果，但在一項臨床試驗中，患兒出現了嚴重的免疫反應［28］。最近，研究顯示，微肌營養不良蛋白的交貨使用AAV載體可以減少在DBA/2J-mdx小鼠，對于DMD嚴重mdx小鼠的骨骼肌炎癥和纖維化，但該療法尚未經過臨床測試［29］。

3.5.3 提前終止密碼子通讀 提前終止密碼子通讀是指當提前終止密碼子（Ptc）位于DMD基因的編碼區域時，就會發生無義突變，翻譯過程被迫終止，導致功能失調的肌營養不良蛋白形式被截斷［30］。通過多項體外研究闡明，慶大霉素等氨基糖苷類藥物可成功抑制多種不同MRNA中PTCs的翻譯終止，恢復哺乳動物細胞中相關蛋白的生理功能。其不良作用包括如耳毒性、腎毒性［31］。但氨基糖苷類有優先與線粒體核糖體結合的特性，目前研究采用較低毒性雜交脂質體包裹的慶大霉素能有效恢復mdx小鼠骨骼肌中肌營養不良蛋白的表達，適合長期抑制治療［32］。此外，一種非氨基糖苷類抗生素已被證實能抑制哺乳動物細胞中的Ptc。negamycin是一種肽類抗生素，修復mdx小鼠骨骼肌和心肌的肌營養不良，比慶大霉素的毒性更小［33］。另一個Ptc抑制基因是ataluren，廣泛的臨床前研究表明，ataluren安全可用，比抗生素具有更特定的功能（不影響脫靶部位，如溶酶體膜）。然而對于其療效現仍有爭議，目前需要進一步研究證明［34］。

3.5.4 基因編輯 使用CRISPR/Cas9系統可在mdx小鼠和犬體內進行基因編輯，可見骨骼肌和心肌中肌營養不良蛋白恢復，并伴有肌膜上DGC成分的重新定位和骨骼肌功能的改善。CRISPR/Cas9技術基組水平上模擬外顯子跳躍效應，恢復DMD開放閱讀框，并生成擁有部分功能的營養不良蛋白。通過CRISPR/Cas9技術，在去除mdx小鼠中突變的22、23外顯子實驗和在缺失DMD基因44和50外顯子小鼠的實驗中，取得了很好的療效［34］。

3.6 干細胞治療 干細胞治療是基于異體或自體的細胞移植，其目的是再生患者受損的組織或器官，并補充特定的干細胞群。在DMD的情況下，主要的目標是用肌營養不良蛋白感受態細胞重建衛星細胞池，從而由于表達肌纖維的肌營養不良蛋白存在而恢復肌肉功能。細胞來源可以來自自體或者供體［35］。目前研究的人類細胞治療方法可根據技術和/或使用的細胞的性質分為3類：⑴部分或完全分化的細胞，⑵胚胎干細胞，⑶誘導多能干細胞。部分或完全分化的細胞此組包括肌衛星細胞，骨骼肌醛脫氫酶陽性細胞，間充質干細胞和間血管細胞和CD133+細胞。將成肌細胞移植到免疫抑制的mdx小鼠后，看到了可喜的成果。但由于免疫反應，在一項男童的試驗中并未成功［14］。但在一項mdx小鼠實驗中，源于系統性抗肌萎縮蛋白表達嵌合細胞成功移植了成肌細胞DEC和間充質干細胞，結果顯示有心肌功能的改善［36］。

有研究發現，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統（一種融合到dCas9中的轉錄激活因子）可以靶向并精確重塑內源性Oct4或Sox2基因位點，使修飾后的細胞系有效地向多能細胞重編程，這表明基因編輯和干細胞療法相結合有望成為DMD的新療法［37-38］。

4 總 結

DMD是一種破壞性疾病，其特征在于進行性肌無力，是由于缺乏肌營養不良蛋白引起的，在早期階段，受影響的肌肉會經歷無數次損傷和修復循環，但在后期階段，會逐漸被脂肪和纖維化組織所替代。目前尚無DMD的治愈方法，糖皮質激素是唯一已被證明能將運動障礙延遲1～2年的藥物。目前許多藥物在動物實驗中顯示有效，但在人類中成果不明顯，還需進一步研究，但是在干細胞治療及基因治療中顯示出巨大研究、治療前景。現階段對DMD進行的研究，對未來其治療提供了前進的方向。