微小RNA在子宮內膜蛻膜化中的功能

李洪菀菀，楊潔瓊，張叢

子宮內膜蛻膜化廣義上是指月經周期中子宮內膜在排卵期后發生的一系列變化，包括子宮腺體的分泌轉化、特異性子宮自然殺傷細胞的流入和血管重塑等。子宮內膜基質細胞（endometrial stromal cell，ESC）是子宮內膜中主要的細胞類型。ESC在蛻膜化過程中轉化為分泌型的蛻膜基質細胞，是蛻膜化過程中最主要的改變。狹義上的蛻膜化僅指ESC的形態改變和生化重編程[1]。不同于大多數哺乳動物，人類的蛻膜化過程不依賴于胚胎著床，是月經周期中的自發性過程，由排卵后孕酮水平上升和局部環磷酸腺苷生成驅動。孕酮和環磷酸腺苷通路在轉錄組和蛋白質組水平的調控使蛻膜基質細胞能夠調節滋養細胞的侵襲，抵抗炎癥和氧化損傷，抑制局部母體免疫反應，為胚胎著床和維持妊娠做好準備[2]。若無胚胎著床，蛻膜化的內膜剝脫導致月經發生和子宮內膜周期性再生[3]。蛻膜化在妊娠和月經周期中具有重要作用，蛻膜化不良與反復種植失敗、子宮內膜異位癥和子癇前期等多種女性疾病的發生有關，嚴重損害女性健康。

大量相關研究相繼發現，許多分子參與了蛻膜化過程，并在子宮內膜蛻膜化和胚胎著床過程中發揮相當重要的作用。蛻膜特異性分子標志因物種而異，人類的蛻膜標志分子主要包括催乳素（prolactin，PRL）和胰島素樣生長因子結合蛋白1（insulin-like growth factor-binding protein 1，IGFBP1）等。這一系列細胞因子、轉錄因子和生長因子在子宮內膜蛻膜化的進程中起著至關重要的作用。近期眾多研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）能夠通過對蛻膜化關鍵基因的作用調控蛻膜化，一些miRNA表達的改變與蛻膜化受損所致的疾病有關。miRNA在多種體液中存在，可能作為疾病診斷和預后的標志物[4]?，F對miRNA在蛻膜化中的作用機制進行綜述。

1 miRNA概述

miRNA是一類內源性的長約22個核苷酸的非編碼RNA，通過序列特異性結合發揮重要的生物學功能。miRNA最經典的調控方式是轉錄后調控。miRNA的5′序列被稱為“種子區域”，靶向mRNA的互補區域，從而介導mRNA的降解或翻譯抑制。因此，絕大多數已知的miRNA對相應的靶基因發揮負向調控作用[5]。早期研究認為mRNA上的靶序列僅位于3′非編碼區（3′-untranslated regions，3′-UTR），但近年的研究表明miRNA也能夠結合5′-UTR和編碼區，體現了其更廣泛的調節能力[6]。生物信息學預測大量基因包含miRNA靶點[7]，近年亦有研究報道miRNA參與基因轉錄水平的調控。研究發現一類核內的miRNA能夠通過與增強子區結合，上調鄰近靶基因的表達水平[8]。由此可見，miRNA在細胞中的調控作用是精密且復雜的。

2 miRNA合成酶與子宮內膜蛻膜化

miRNA的生物合成受到嚴格的時間和空間控制，它們的失調與許多人類疾病有關。動物miRNA的合成始于細胞核內，miRNA的編碼基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉錄后形成miRNA初始轉錄本（primiRNA）。此時，RNA結合蛋白DGCR8和一種Ⅲ型核糖核酸酶Drosha組成微處理蛋白復合物，特異性識別pri-miRNA莖環基部并切割雙鏈，釋放一個約60～70個核苷酸的莖環結構中間體，即miRNA前體（premiRNA）。核內的pre-miRNA由Exportin-5-Ran-GTP復合物轉運出核。在細胞質中被RNA結合蛋白TRBP招募的另一種Ⅲ型核糖核酸酶Dicer切割莖環的底部，使pre-miRNA分解為成熟長度的RNA雙鏈，其中包括成熟miRNA及其反向臂片段[9]。miRNA的生物合成在多個層面受到調控，包括：①miRNA轉錄水平調控；②Drosha和Dicer分別在細胞核和細胞質中對其進行加工；③通過RNA編輯和RNA甲基化、尿苷化、腺苷酸化對其進行修飾；④AGO蛋白質的裝載；⑤RNA衰變。miRNA生物合成也可以通過非常規途徑實現，包括那些獨立于Drosha或Dicer的途徑，也正在陸續被發現。

月經周期中，隨著蛻膜化進展，分泌晚期的子宮內膜基質中Dicer蛋白水平升高[10]。Estella等[11]研究表明，用雌二醇+孕酮和環磷酸腺苷+甲羥孕酮兩種最常用的方案體外誘導人子宮內膜基質細胞（human endometrial stromal cell，hESC）蛻膜化后，Dicer轉錄水平上調。敲低Dicer再行誘導蛻膜化，hESC中同源框基因A10（HOXA10）蛋白水平下降且細胞內肌動蛋白分布發生改變，提示蛻膜化受抑制。有研究表明，HOXA10影響ESC對孕酮的響應，HOXA10缺失導致蛻膜化障礙和胚胎植入障礙。另有研究發現，Drosha蛋白在孕5～7 d的小鼠胚胎著床部位周圍的蛻膜基質細胞中高表達。小鼠在體人工誘導蛻膜化和小鼠ESC體外誘導蛻膜化均能導致Drosha蛋白表達上調，且隨體外誘導蛻膜化程度的加深而逐步升高[12]。這兩種關鍵合成酶在蛻膜化過程中的改變為miRNA參與蛻膜化調控提供了重要依據。

3 參與子宮內膜蛻膜化調控的miRNA

3.1 促進蛻膜化的miRNA

3.1.1 miR-21Hu等[13]發現孕5～8 d小鼠子宮內胚胎種植位點miR-21的表達水平上升，且著床部位miR-21表達水平高于著床位點間部位，其下游靶基因RECK的時間及空間分布與之相反。RECK過表達抑制了ESC中蛻膜化標志分子基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達。MMP在子宮內膜的蛻膜化、滋養層遷移、侵襲、血管生成和細胞外基質重塑中起著重要的作用。另一項研究則發現miR-21通過調節Krüppel樣因子12（Krüppellike factor 12，KLF12）和NR4A1的表達促進體外誘導的hESC蛻膜化[14]。子宮腺肌病患者子宮內膜miR-21表達降低，過表達miR-21可以逆轉子宮腺肌病患者離體培養的hESC蛻膜化不足。蛻膜中的miRNA還能以外泌體的形式進入細胞外液，Lv等[15]研究發現miR-21在孕小鼠子宮外泌體中表達增加，且可通過上調胚胎中miR-21的水平來抑制胚胎凋亡，促進胚胎發育，為蛻膜化與妊娠調控提供了新的視角。

3.1.2 miR-181aSu等[16]對孕豬子宮內膜miRNA的微陣列芯片分析發現，miR-181家族中的兩個成員miR-181a和miR-181c在胚胎種植期表達升高。隨后有研究表明miR-181a在hESC體外誘導蛻膜化后升高，并且過表達miR-181a可促進hESC的體外蛻膜化。KLF轉錄因子家族成員在胚胎植入過程中的母體子宮內膜發育中發揮作用，其中KLF12是hESC蛻膜化的主要的負調節因素之一。miR-181a直接靶向抑制KLF12，促進蛻膜化進程[17]。另外，miR-181a在子癇前期患者蛻膜間充質干細胞或蛻膜基質細胞中表達改變，可能參與了子癇前期的發生發展[18]。

3.2 抑制蛻膜化的miRNA

3.2.1 miR-135bmiR-135b在反復種植失敗患者的子宮內膜中表達升高。Zhao等[19]發現miR-135b通過靶向結合蛻膜化中重要的調節因子HOXA10抑制其表達，這一調控關系與Riyanti等[20]在不孕癥患者中的發現一致。而Wang等[21]則提出，miR-135b抑制了轉錄因子FOXO1的表達，使其無法結合到PRL啟動子區以激活PRL的轉錄。這兩種作用最終都導致了hESC體外誘導蛻膜化受損，可能是miR-135b影響子宮內膜容受性的原因。此外，Petracco等[22]還發現子宮內膜異位癥患者在位內膜與異位內膜間miR-135b的表達存在差異，推測其可能與子宮內膜異位癥的病理過程有關。

3.2.2 miR-145miR-145在大鼠孕早期和在體人工誘導蛻膜化模型中表達下調，體外誘導大鼠ESC蛻膜化過程中過表達miR-145可阻礙蛻膜化過程[23]。研究預測并驗證了SMAD3是miR-145的直接靶點，miR-145可 抑 制SMAD1及 下 游p-SMAD1/5/8、WNT4、MMP-9、環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達。而且，利用過表達miR-145的ESC培養基培養臍靜脈內皮細胞，可抑制血管內皮細胞的侵襲和遷移，這意味著miR-145可能參與蛻膜對血管生成的調控。另外，Smad1基因敲除的小鼠表現出部分蛻膜受損，其機制可能是由蛻膜相關基因[如骨形成蛋白2（BMP2）、WNT4和COX-2]的失調引起的。血管生成是蛻膜支持滋養層侵襲的先決條件，血管生成不良可能導致種植失敗及子癇前期等不良后果。Revel等[24]對反復種植失敗患者和正常生育婦女的子宮內膜miRNA譜進行了比較，發現13個miRNA差異表達，其中miR-145在反復種植失敗患者的表達量為正常生育婦女的3倍。另外，Bashti等[25]對55例子宮內膜異位癥和23例正常女性血漿標本進行分析發現，miR-145在Ⅰ期或Ⅱ期子宮內膜異位癥患者中表達升高，提示miR-145或可用于子宮內膜異位癥的早期診斷。

3.2.3 miR-181b與同家族成員miR-181a不同，研究發現miR-181b-5p在hESC體外誘導蛻膜化時表達下調[11]。在hESC體外誘導蛻膜化的過程中，miR-181b-5p通過調控金屬蛋白酶組織抑制劑3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）、ANXA2等與細胞遷移相關的蛋白發揮作用[26]。另一項研究則認為，miR-18b1b-5p通過調控骨橋蛋白（osteopontin，OPN）參與VEGFA/血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）通路抑制hESC體外誘導蛻膜化[27]。該研究還比較了在體外受精-胚胎移植治療過程中種植成功與種植失敗患者的子宮內膜OPN水平，發現種植失敗組OPN表達較低，說明這一通路可能影響了胚胎種植。

3.2.4 miR-222Qian等[28]對體外誘導蛻膜化與陰性對照的hESC進行miRNA微陣列芯片分析并由熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR）驗證，發現包括miR-222在內的10個miRNA在蛻膜化處理組表達降低。同時，蛻膜化處理組中hESC處于S期的細胞比例減少，處于G0/G1期的細胞比例增多。靶向敲除miR-222可上調周期蛋白依賴激酶抑制因子1C（CDKN1C）的表達，從而減少hESC中S期細胞的數量。miR-222表達降低使細胞退出增殖周期而進入分化進程，發生蛻膜化改變。另外，一項隊列研究發現韓國女性中miR-222基因多態性與反復種植失敗風險相關[29]。

3.2.5 miR-542-3pTochigi等[30]利用miRNA微陣列芯片分析鑒定得出，hESC體外誘導蛻膜化組與陰性對照組有6個差異表達的miRNA，蛻膜化組中miR-542-3p表達水平較陰性對照組下調70%。miR-542-3p直接靶向抑制IGFBP1，從而抑制hESC的形態改變和蛻膜化關鍵基因PRL、WNT4的表達。該課題組進一步研究發現高遷移率族蛋白N5（high-mobility group N5，HMGN5）是miR-542-3p的上游調控蛋白，這種核蛋白通過與染色質纖維中的核小體核心顆粒特異性結合改變染色體致密程度，HMGN5表達下降導致染色體纖維致密化，抑制miR-542-3p的生成[31]。Qu等[32]研究則認為miR-532-3p通過靶向抑制整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）表達，導致轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）信號通路中的重要分子TGF-β1和SMAD2表達下調，從而影響蛻膜化。在hESC中過表達miR-542-3p可抑制VEGF、COX-2和MMP-9的表達，其培養基上清液具有抑制人臍靜脈內皮細胞的血管生成作用，提示miR-542-3p可能參與子宮內膜容受性損傷、子癇前期等病理、生理過程。

3.2.6 其他抑制蛻膜化的miRNAYang等[33]研究發現過表達miR-290-5p可降低N-myc下游調節基因3（N-myc downstream-regulated gene 3，NDRG3）的表達，抑制小鼠ESC體外蛻膜化，這與NDRG3激活RAF-細胞外調節蛋白激酶（ERK）通路進而促進細胞生長和分化有關。Pei等[34]研究表明，miR-194-3p通過對孕酮受體（progesterone receptor，PGR）的負調控抑制hESC體外誘導的蛻膜化，而輕度子宮內膜異位癥患者分泌中期在位子宮內膜中miR-194-3p表達增加，PGR表達減少。Zhou等[35]發現miR-196a抑制hESC蛻膜化，且在輕度子宮內膜異位癥在位內膜中表達顯著增加。雖然該研究并未找到miR-196a的直接靶基因，但發現miR-196a表達的升高導致磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK）/p-ERK蛋白表達上調和PGR-A、PGR-B蛋白表達下調。Pei等[34]和Zhou等[35]認為miR-194-3p、miR-196a和各自下游通路可影響子宮內膜異位癥患者內膜的孕激素抵抗。在小鼠延遲種植受體模型中發現，miR-101a和miR-199a*表達在時間及空間上的分布與COX-2有關，并發揮負向調控作用，miR-101a在蛻膜化過程中的表達與COX-2蛋白水平呈負相關[36]。而COX-2被廣泛證實在妊娠早期蛻膜化和著床中起到促進作用[37]。miR-96通過調控細胞凋亡抑制小鼠ESC體外誘導的蛻膜化水平，這與miR-96靶向下調抗凋亡因子B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）有關[38]。miR-148a-3p在反復種植失敗患者內膜中表達升高，且過表達miR-148a-3p或抑制其靶基因HOXC8的表達均能使hESC體外誘導蛻膜化受損[39]。此外，miR-149通過與多腺苷二磷酸核糖聚合酶2[poly（ADP-ribose）polymerase-2，PARP-2]作用抑制hESC的蛻膜化，參與子宮內膜容受性的調控[40]。

4 結語與展望

一些miRNA參與了子宮內膜蛻膜化的雙向調控，其具體作用機制包括調控激素受體、細胞增殖與凋亡、細胞自噬和細胞周期等。同時，尚有許多測序篩選的差異miRNA的作用有待進一步研究。子宮內膜蛻膜化是人類子宮內膜周期性變化以及妊娠建立和維持至關重要的環節。對于miRNA的研究有助于完善子宮內膜蛻膜化分子調控的網絡，并為蛻膜化受損相關女性生殖系統疾病的診治提供參考。