臨床病原真菌的診斷技術進展*

陶成龍，陳伊巧，劉 傲，楊必文，蘇成康，葉丙剛，郭周義 綜述，劉智明△ 審校

1.廣州浩康生物科技有限公司，廣東廣州 510660；2.華南師范大學生物光子學研究院國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室，廣東廣州 510631 3.廣東食品藥品職業學院軟件學院，廣東廣州 510520

臨床微生物從廣義上可分為三類，即細菌、真菌與病毒。真菌，屬于真菌界，與動物界、植物界、原核生物界以及原生生物界并行。與細菌不同，真菌是真核微生物，有明顯的細胞核和完整的細胞器。真菌廣泛的分布在自然界中，當人體免疫力下降或者受損時，容易遭到真菌侵襲，引起真菌病。據統計，近年來由于糖皮質激素、廣譜抗菌藥物的濫用，耐藥真菌不斷出現。如在之前的資料中有報道，美國出現了抗藥性強的“超級真菌”耳道念珠菌[1]，這些抗性真菌的出現使得真菌診斷治療更加困難。

目前，臨床常用的檢測方法為鏡檢法、培養法與組織病理法。但這些方法均與檢驗醫師的專業水平息息相關。自然界中大多數細菌生長速度較快，而真菌與細菌不同，生長速度往往較慢，生長條件更為苛刻，其結構也更為復雜，沒有特異性的臨床表現，極易造成漏診誤診，傳統的金標準培養法耗時過久。因此建立快速診斷病原真菌的方法極有必要。本文針對臨床微生物中真菌感染的檢測診斷手段以及診斷現有技術進行介紹。

1 形態學檢測法

真菌有明顯的形態特征，如孢子、菌絲。采用形態學觀察法可初步對樣本進行預判，由此誕生了鏡檢法。在淺部真菌的診斷中，濕片法[氫氧化鉀(KOH)法]，即取病變的皮屑部位，通過10%的氫氧化鉀加熱后直接鏡檢，觀察到真菌組織后，即可診斷為真菌感染。傳統的培養法將樣本進行適當處理后接種于合適的培養基，適宜溫度培養，觀察菌落特征、菌絲以及孢子的特征繼續鑒定。雖然培養法一直作為真菌診斷的金標準，但事實上其耗時過長，無論是淺部真菌感染還是深部真菌感染，診斷速度都非常重要。

現有技術結合不同種類的染料對傳統的鏡檢法進行了不斷升級與延伸。熒光增白劑法，如Blankophor和Calcofluor white，其可以與真菌中的殼多糖和纖維素特異性結合，在熒光顯微鏡下，真菌孢子及菌絲發出黃綠色或淡藍色熒光，與暗背景形成鮮明對比。與濕片法相比，該法檢測皮膚和指甲樣品中的真菌成分更快[2]。CARD等[3]通過研究熒光素對植物內生菌絲的染色發現，5-氯甲基熒光素二乙酸酯(CMFDA)對真菌菌絲的染色強度最大，且受光漂白的影響也最小。現在市面上已經有成熟的商業化檢測試劑。羅云鵬等[4]對比了特敏增強熒光染色液、鈣熒光白(Calcofluor white)、濕片法(KOH)3種染色方法，特敏增強熒光染色法檢出率高于鈣熒光白染色法和濕片法(χ2=17.984，P<0.05;χ2=32.063，P<0.05)，試驗結果證明了該方法簡單、速度較快。但熒光染色法中熒光染料的穩定性、淬滅度、生物相容性仍然需要解決。

2 血清學檢測法

血清學檢測主要包括抗原、代謝產物和抗體檢測[5]。

2.1抗原與代謝產物檢測技術

2.1.1G試驗與GM試驗 β-1,3-D-葡聚糖(BDG)廣泛存在于真菌細胞壁中，可占其干質量的50%以上。在沒有內毒素的情況下，其可激活鱟試劑變形細胞裂解液中的G因子，產生凝集反應。基于此反應原理的G試驗可以特異性檢測BDG[6]。GM是曲霉菌的特異性抗原，曲霉菌菌絲生長時，GM從薄弱的菌絲頂端釋放，是感染過程中最早釋放的抗原。GM的釋放量可以反映感染程度，所以可以作為療效的評價指標。但是當大劑量使用激素時，GM試驗可能出現假陽性[7]。也有研究表明，G試驗和GM試驗聯合檢測可更有效診斷侵襲性曲霉病[8]。

2.1.2隱球菌莢膜多糖抗原檢測 隱球菌感染后，體內可形成大量莢膜多糖，釋放到血液和腦脊液中。乳膠凝集試驗是檢測隱球菌莢膜抗原最有價值的快速血清學方法之一，可快速、準確地檢測腦脊液或血液中的多糖抗原，其靈敏度高于傳統的印度墨汁染色和菌培養[9]。現有的隱球菌抗原檢測商品化試劑盒采用多克隆抗體捕獲抗原,再用單克隆抗體進行檢測,可同時提高靈敏度和特異度。此外，通過對莢膜多糖抗原的定量檢測可用于對患者的療效評價,但在免疫功能低下患者中應用時應結合其他檢測結果進行解釋[10]。

2.2抗體檢測技術 以往的研究普遍認為抗體檢測的特異性較差，不能區分是體內定植還是感染，而機會性真菌感染常發生在機體免疫功能低下的人群，難以產生足夠量的抗體，易發生假陰性[11]。目前，已有對白念珠菌、曲霉菌的抗體檢測方法[12]，真菌特異性抗體檢測已經成為檢測真菌病的一種重要方法。一項納入血液腫瘤和危重患者的系統性回顧研究顯示，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗體聯合檢測優于其單獨檢測，靈敏度和特異度分別達83%和86%[13]。2016年更新的美國感染病學會(IDSA)曲霉病診斷與處置指南中，強烈推薦血清和BALF GM試驗用于血液病患者侵襲性曲霉病的檢測[14]。

3 分子生物學診斷方法

近年來，由于分子生物學的迅速發展與崛起，越來越多的分子生物學手段應用于病原體檢測中[15]。其方法準確，速度較快、特異性高、靈敏性強，且不需要臨床經驗[16]。針對核酸的基因檢測系列方法可以避免鏡檢法所受的形態學限制，并且可實現精準的菌種鑒定甚至是定量分析。但真菌的細胞壁較為堅硬，需要良好的前處理方法進行細胞壁的破碎，涉及皮膚樣本的處理，減少干擾。現在已有的分子生物學手段大致為以下幾種。

3.1常規PCR技術及其衍生技術 由于細菌或真菌在基因水平上都有特異的靶基因，采用設計好的通用引物，通過PCR技術擴增特異的目的靶基因可以實現種類的判定。引物的選擇和設計是采用PCR技術檢測病原體的首要關鍵。rRNA常用于設計通用引物，與rRNA的18S、28S、5.8S rRNA基因組序列相比較，內轉錄間隔區(ITS)作為非編碼區具有更高選擇性，并且能夠提供詳盡的系統學分析所需要的可遺傳性狀,因此最常用來進行引物設計[17]。在系統發育的研究上，PCR技術也被用來進行分析，這也為真菌的特異性診斷提供了基礎。在常規PCR的基礎上，衍生了熒光定量PCR、環介導等溫擴增(LAMP)等技術。

3.1.1熒光定量PCR 熒光定量PCR也常稱作qPCR，其是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。隨著擴增循環的進行，qPCR儀器以圖形方式實時顯示輸出。輸出通常通過熒光來檢測，這可以簡單到測量雙鏈產物的量，或者向反應中加入對擴增子內靶序列特異的探針，可以使用多個探針來產生多重反應。現有方法將多重PCR與熒光定量PCR結合，發展為多重熒光定量PCR。將針對部分病原體16S rRNA和rpoB基因序列的PCR與使用SYBR Green qPCR的單次運行程序中的組合ITS/LSU序列與Sanger測序相結合，該方法成為僅在2 d內鑒定細菌和真菌的合適工具[18]。但熒光定量PCR所需要的儀器與相關試劑價格都相對昂貴[19]。

3.1.2等溫擴增技術 常規PCR需要經過變性、退火、延伸3個變溫步驟。與常規PCR技術不同，LAMP是一種等溫PCR技術，在60～65 ℃下進行，可以利用聚合酶在合成新鏈時置換其中一條DNA鏈，達到擴增核酸的目的。LAMP使用4個引物而不是通常的2個，這提供了比典型引物更大的特異性，盡管引物設計更具挑戰性[20]。LAMP已經應用于許多主要的真菌病原體鑒定[21]。用于真菌鑒定的第二種等溫擴增方法稱為基于核酸序列的擴增(NASBA)，它使用核糖核酸作為模板。這種反應通常在41 ℃下進行，目標RNA可以以數千份的形式存在。在侵襲性曲霉病的研究中，ZHAO等[22]發現，NASBA與美國食品和藥物管理局(FDA)批準的血清學鑒定法有很好的相關性。用于真菌鑒定的第三種等溫擴增方法是滾環擴增(RCA)。RCA使用病毒聚合酶以圓形模板的形式擴增靶序列。這種方法的主要優點是，它可以將靶擴增到超過109個拷貝，幾乎不需要優化，并且耐污染，而這是其他PCR的主要缺陷[23]。RCA已經成功地應用于毛霉菌[24]、隱球菌[25]的檢測中。

3.2核酸雜交技術 核酸雜交技術是利用核酸探針來檢測DNA或RNA的特定基因序列。包括Northern 雜交、Southern 雜交、熒光原位雜交、基因芯片技術等等[26]。目前已經衍生出了可用于檢測念珠菌與曲霉菌的熒光原位雜交(FISH)技術，相比傳統的核酸雜交技術，其穩定性更好。FISH以rDNA序列為檢測目標[27]。該方法對標本的前處理要求低，規避了樣品準備瓶頸，有助于快速檢測周轉時間。該分析的變體包括肽核酸FISH，它利用肽核酸作為探針，由于骨架電荷為中性，所以結合得更牢固，反應更靈敏。由于這種檢測方法速度快，可以直接在血液等臨床標本上進行，并且只需要很少的樣品制備，因此它已經用于念珠菌的檢測多年了。市場上有2種FDA批準的PNA-FISH產品[28]。多年來已經開發了多種基于陣列的雜交策略，并且通常通過使用PCR擴增子作為靶陣列的雜交探針來工作。這些方法的一個優點是，目標可以像單個物種特異性寡核苷酸一樣簡單，同時也允許一次鑒定大量的樣本。

4 生物傳感器方法

生物傳感器的核心成分是通過物理或化學方法固定在電極表面的生物識別元件。目前在細菌與真菌的檢測中均有應用，生物傳感器大致分類可為以下三類：電化學生物傳感器、核酸生物傳感器、光學生物傳感器。

4.1電化學生物傳感器 電化學生物傳感器的核心成分是通過物理或化學方法固定在電極表面的生物識別元件。生物傳感器的特定識別功能，可以選擇性地識別目標分子并將其捕獲到電極表面，信號轉換為電流、電壓和電阻等可進行測量和分析得參數，從而實現分析目標的定性或定量分析。有學者研制了一種用于檢測病原真菌紅色毛癬菌抗原的電流型酶免疫傳感器[29]。

4.2核酸與蛋白生物傳感器 核酸與蛋白生物傳感器，即利用核酸或蛋白作為識別元件，常用的如適配體。適配體是通過指數富集系統進化技術(SELEX)體外篩選所獲得的小分子的物質，如寡核苷酸序列、蛋白等。核酸檢測生物傳感器適用于各種各樣的基因檢測，既能用于遺傳性疾病基因缺失突變檢測，也能進行疾病和藥物易感基因檢測。此外，已有研究應用多肽來檢測常見的病原真菌白色假絲酵母[30-32]。

4.3光學生物傳感器 光學生物傳感器是利用生物發光、化學發光來檢測病原體是一種光學生物傳感器方法，生物發光是指機體內的物質在酶的作用下將化學能轉化為光能，其中ATP生物發光應用廣泛且靈敏度高。化學發光是指物質分子在化學反應過程中產生光輻射的現象，這種現象避免了光的干擾。表面等離子體共振、光纖和激光也常用來檢測病原體。

4.3.1拉曼光譜技術 拉曼光譜是一種散射光譜，拉曼散射中的能量的變化表征了分子和化學鍵的特征，體現了物質的結構特征，其具體表現形式就是拉曼位移。因而人們把拉曼光譜稱為物質的“指紋”。蛋白質、糖類、核酸等大分子都可以產生這種特異性指紋，這就為病原的檢測提供了可行的理論基礎[33]。

表面增強拉曼光譜技術是將物質分子吸附在基底或納米材料表面，能夠放大若干倍正常的信號強度，使得前菌培養的程序簡化，并且可以有效地縮短檢測時間，實現單分子檢測。鑒于真菌獨特的細胞壁結構，表面增強拉曼光譜在檢測真菌的研究上有著廣闊的前景，有研究用脫氧核糖核酸功能化的銀羥胺納米粒子來檢測白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和煙曲霉的感染，利用主成分分析，可以檢測每個目標的個體存在，并相應地對它們進行分組[34-35]。尋找性能好、價格適宜的基底材料是研究的重點，并且儀器的便攜性也需要考慮。

4.3.2傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)技術 FT-IR是將紅外光譜和計算機技術相結合的分析方法，紅外光譜的強度h(δ)與形成該光的兩束相干光的光程差δ之間有傅里葉變換的函數關系，干涉圖上每個頻率解釋為相應的光強，紅外光譜圖不同的特征，表示這未知物化學結構、物質的純度等，可用于臨床真菌的檢測。有研究取50例淺表真菌感染患者的樣品使用FT-IR顯微光譜進行研究。同一物種的光譜是相同的，而不同物種的光譜沒有顯示出相似性。這項研究表明，FT-IR可用于獲得念珠菌和皮膚真菌物種的“分子指紋”[36]。但該光譜對于樣品的前處理要求比較高，水分子有較強的紅外吸收，為避免對其他光譜特征的干擾，需要合理地干燥樣品。

4.3.3熒光適配體技術 適配體目前已經被廣泛應用于構建光學生物傳感器。熒光適配體主要是用熒光基團標記配體，待檢測物與適配體作用后產生熒光偏振。Luminex公司的核心技術xMAP是用不同配比的不同種熒光染料將直徑為5.6 μm或6.5 μm的聚苯乙烯微球染成不同的熒光色，以此獲得不同種類的熒光編碼微球。針對不同待測物質的抗體分子或基因探針用共價交聯的方式結合到待定的編碼微球上，使其均有對應的檢測項目。根據待測物質與對應熒光球的混合形成復合物，復合物與標記的熒光素反應，在紅綠激光的作用下，進行識別與判定[37]。FAROOQI等[38]將xMAP技術成功地用于鑒定念珠菌屬中的單個真菌菌種。此外，還有納米材料修飾等方法。熒光基因標記適配體存在著熒光激發、淬滅等相關問題。

5 展 望

5.1與人工智能結合 與人工智能技術相結合是世界科技發展的主流趨勢。人工智能技術目前應用的范圍較廣，近年來越來越多地被應用于醫學研究與臨床系統。有學者利用深度學習的方法與拉曼光譜檢測法相結合，生成了一個廣泛的病原體拉曼圖譜數據庫，即使在低信噪比譜上，也能達到平均分離水平超過82%的準確率和(97.0±0.3)%的抗菌藥物治療識別準確率[39]。有學者將顯微鏡觀察與人工智能技術相結合，采用數字處理、模式識別來獲得真菌特征，采用人工神經網絡系統從排泄物中識別出真菌[40]。目前市場上已有該類型的產品。人工智能技術還可以與光學的檢測手段進行很好結合，這也為真菌快檢與人工智能相結合提供基礎。

5.2新材料的結合 新材料的發展在檢驗科學的領域也起到了重要作用，納米材料有良好的光學性能與電學性能，在生物傳感器的制作上可以起到改善穩定性的作用。如金屬納米材料，其比表面積大且有良好的生物相容性，在信號響應上有放大的效果，常被用來制備適配體。且納米材料的溶液顏色與粒子直徑大小相關，這一顏色變化可以很好地應用在檢測領域中。例如，結合凝集素的納米材料量子點可用作碳水化合物表達分析的納米探針，它可提供與癌癥和微生物致病性相關的糖基化變化信息，已經應用于白色念珠菌細胞的熒光標記[41]。納米材料性能雖然較好，但存在制備效率、生物毒性評價、價格昂貴等問題。

6 小 結

本文介紹了臨床及市場上病原真菌的檢測方法，目前臨床常見與常用的仍是濕片法及結合熒光染色的鏡檢法、培養法等。目前有越來越多的檢測方法用于真菌病的診斷，但技術的可行性距離實際的市場應用仍有很大距離，進入市場應用要考慮經濟性和實用性。目前真菌病的特異性檢測仍主要依賴于分子生物學的診斷方法，對設備與檢驗人員的技術要求均較高。通過交叉學科的方法提高特異度、靈敏度、檢測速度將會一直是病原真菌快速檢測的主要研究內容。