NETs與急性呼吸窘迫綜合征的研究進(jìn)展

王行行，王導(dǎo)新

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 重慶 400010)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指各類非心源性因素引起，種種肺內(nèi)或者肺外因素而導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭。病理生理主要特征是肺毛細(xì)血管通透性增加、肺容量減少、肺部順應(yīng)性降低、嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào)。最常進(jìn)展到ARDS的疾病為膿毒癥和肺炎。盡管近期ARDS治療已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步，高達(dá)45%的病死率依然使其成為人們廣受關(guān)注的疾病。彌漫性肺泡損傷是重要病理特征之一，而中性粒細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，在此過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，了解它的具體作用機(jī)制有助于找尋ARDS的新治療方法。

當(dāng)病原體進(jìn)入到機(jī)體中，中性粒細(xì)胞是宿主抵抗的第一道防線的重要構(gòu)成成分。它可以通過(guò)吞噬內(nèi)化胞外病原體、脫顆粒釋放出多種具有免疫效應(yīng)的蛋白質(zhì)等方式來(lái)破壞病原體和清除感染。其中有一種新型的抗菌機(jī)制：中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，開(kāi)辟了研究的新方向。中性粒細(xì)胞刺激后能產(chǎn)生一種以DNA為骨架，結(jié)合有相關(guān)組蛋白、顆粒蛋白和酶的物質(zhì)，包括中性粒細(xì)胞彈性酶(neutrophil elastase，NE)、組織蛋白酶G(cathepsin G)、a-防御蛋白1-3(a-defensins 1-3)、NADPH氧化酶(NADPH oxidase)和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)。多項(xiàng)研究表明，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在ARDS的病理生理過(guò)程中有關(guān)鍵作用，為ARDS的治療帶來(lái)新的希望，成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。以下為NETs與ARDS的研究進(jìn)展綜述。

1 NETs概述

在各種病原體、鈣離子[1]、佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)[2]、TNF-α、IL-1β等促炎物質(zhì)[3]、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、組蛋白[4]和干擾素[5]等的刺激下均可誘導(dǎo)NETs形成。 NETs形成(NETosis)主要包括兩種機(jī)制：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)依賴性和NOX非依賴性。

NOX依賴性：大部分研究都指出了這種方式。當(dāng)中性粒細(xì)胞接受到刺激信號(hào)后，可以激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)隨即激活位于其下游的信號(hào)通路Raf/MERK/ERK[2]，NADPH氧化酶活化從而產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS能夠向肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylargin-ine deiminase 4，PAD4)等發(fā)送正反饋信號(hào)，組蛋白會(huì)被催化，發(fā)生瓜氨酸化，并且使得核染色體解聚。與此同時(shí)，鈣離子內(nèi)流，它是PAD4的輔酶，能夠使染色體加速解聚。嗜天青顆粒是一種溶酶體，位于胞質(zhì)，具有多種酶，它能產(chǎn)生中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，這是NOX依賴性的NETosis進(jìn)程中必不可缺的兩種物質(zhì)。經(jīng)過(guò)這一系列的反應(yīng)后，中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜支解，NETs釋放到胞外。

NOX非依賴型：細(xì)胞外鈣離子載體的內(nèi)流，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ROS的產(chǎn)生。同時(shí)，鈣離子載體可以調(diào)動(dòng)位于細(xì)胞內(nèi)的鈣池，特別是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣池。盡管此種方式不依賴于NOX產(chǎn)生的ROS，但是鈣離子載體會(huì)引起線粒體ROS的釋放。

NETs可以捕捉、中和和殺死細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲，也能防止細(xì)菌和真菌的播散，但是過(guò)量的NETs生成會(huì)引起很多疾病。

2 NETs在ARDS發(fā)病機(jī)制中的作用

ARDS可以是肺內(nèi)或者肺外因素引起，但這兩種情況均有大量的中性粒細(xì)胞進(jìn)入肺部這一特征。肺內(nèi)疾病中肺部感染，是引起ARDS的重要原因，在肺炎患者中可以檢測(cè)到NETs明顯升高，并且高濃度的NETs與治療、住院和康復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，病死率的增加密切相關(guān)[6]。在膿毒癥的患者當(dāng)中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全血NETs的中性粒細(xì)胞的表面標(biāo)志物和NETs的循環(huán)標(biāo)志物，所有標(biāo)志物與健康人相比均增高[7]。在無(wú)菌條件下，建立的外周組織創(chuàng)傷模型和化學(xué)因素引起的肺損傷模型中，線粒體DNA通過(guò)環(huán)磷酸鳥苷合成酶(GMP-AMP synthase，CGAS)與Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR 9)通路作用于中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生NETs[7]。

2.1 NETs對(duì)肺組織的直接損傷

NETs的細(xì)胞毒性作用主要是由組蛋白介導(dǎo)的。在體外，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞與組蛋白2A型的共孵育發(fā)現(xiàn)，組蛋白能抑制細(xì)胞增殖，并以濃度依賴的方式激發(fā)細(xì)胞毒性。如果破壞NETs的DNA骨架，不會(huì)改變NETs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。活化蛋白C(activated protein C，APC)可以減弱純化體系中組蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，但并沒(méi)有改變NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，說(shuō)明NETs中的組蛋白能被保護(hù)，防止被APC降解。

除組蛋白以外，NETs的其他成分也有直接損傷作用。髓過(guò)氧化物酶會(huì)破壞肺泡和支氣管上皮細(xì)胞的DNA，中性粒細(xì)胞彈性酶具有的細(xì)胞毒性也能直接損傷肺上皮。

2.2 NETs對(duì)肺組織的間接損傷

NETs與各種炎性介質(zhì)、免疫細(xì)胞可以相互影響，促進(jìn)ARDS的炎性反應(yīng)。NETs可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞類型分化方向，使得巨噬細(xì)胞向M1類型分化。臨床實(shí)驗(yàn)中，ARDS患者的NETs含量與M1型的巨噬細(xì)胞水平正相關(guān)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在鼠的急性肺損傷組織中檢測(cè)到NETs形成，且與BALF和肺組織中的M1型細(xì)胞增加和M2型細(xì)胞減少相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)中，在與高濃度NETs共培養(yǎng)的從骨髓提取的巨噬細(xì)胞(M0型、M2型)中，能檢測(cè)到有意義的前炎性細(xì)胞因子的分泌和M1標(biāo)志物的上調(diào)，M2標(biāo)志物下調(diào)[9]。M1型細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì) IL-1β，TNF-α等均能引起NETs的生成。在膿毒血癥誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠模型中，可以檢測(cè)出大量NETs和炎性介質(zhì)，向小鼠注射DNA酶破壞NETs后，高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)、IL-6、趨化因子 CXCL1 和趨化因子 CXCL2等膿毒血癥相關(guān)性促炎因子均大幅下降[3]。

NETs與血小板之間有正反饋激活作用，這種正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)了ARDS的進(jìn)展。血小板上的TLR4與中性粒細(xì)胞上的配體結(jié)合，刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，這個(gè)過(guò)程有部分原因是激活的血小板釋放HMGB1，使中性粒細(xì)胞更傾向發(fā)生自噬和產(chǎn)生NETs；而NETs也可刺激血小板表達(dá)TLR4，并且在膿毒癥中，存在促進(jìn)血管內(nèi)凝血和微血管功能障礙的調(diào)節(jié)軸：NETs-血小板-凝血酶[10]。依賴中性粒細(xì)胞提供的平臺(tái)，血小板才得以向肺內(nèi)聚集。

3 以NETs靶點(diǎn)對(duì)ARDS可能有治療效果的方法

3.1 抑制NETs生成

加熱滅活的胎牛血清、人的血清白蛋白、牛血清白蛋白均能抑制LPS誘導(dǎo)的NETs生成，其作用機(jī)制可能是通過(guò)減少中性粒細(xì)胞Ca2+向胞內(nèi)流入有關(guān)[11]。通過(guò)高含量成像和分析的表型分析，發(fā)現(xiàn)野香草(vanilloids)能夠抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而抑制NETs生成[12]。組蛋白能以劑量依賴的方式激活NETs生成，且此機(jī)制不依賴于NADPH，石英晶體微天平系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，重組血栓調(diào)節(jié)蛋白能與組蛋白結(jié)合，抑制NETs生成[4]。在NETs產(chǎn)生過(guò)程中，PAD4等催化組蛋白發(fā)生瓜氨酸化而形成活性，瓜氨酸組蛋白H3(Citrullinated histone H3，CitH3)的單克隆抗體能夠有效減少循環(huán)中的組蛋白H3，從而緩解由于膿毒血癥引起的ARDS[13]。 DNA是NETs的骨架，用DNA酶(DNase)來(lái)抑制NETs形成也成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，在人體的血漿和細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)表面本身就存在的DNase能降解DNA，目前，在心臟和腦部形成梗阻性血栓時(shí)，DNase Ⅰ是一種基礎(chǔ)治療，那么當(dāng)NETs在肺泡快速形成，導(dǎo)致急性肺損傷發(fā)生，吸入DNase Ⅰ或者靜脈系統(tǒng)輸注的方式可能也是有用的；此外，一項(xiàng)前瞻性、多中心、雙盲的隨機(jī)對(duì)照臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，霧化吸入一種重組DNA酶：阿爾法脫氧核糖核酸酶(dornase alfa)能夠減少創(chuàng)傷因素導(dǎo)致的急性肺損傷[14]。納米顆粒介導(dǎo)的西韋司他(sivelestat)可以減少血清中NE和其他的前炎性細(xì)胞因子和NETs生成，減輕肺損傷的臨床表現(xiàn)[15]。間質(zhì)干細(xì)胞、宿主內(nèi)皮來(lái)源的p33均能抑制NETs的生成[16-17]。

3.2 對(duì)抗NET的毒性作用

血漿中自然存在的唾液酸可以減少NETs的影響，多聚唾液酸可以對(duì)抗所有種類的組蛋白的毒性作用，并且這種作用與唾液酸的聚合程度相關(guān)[18-20]。NETs會(huì)抑制肺表面蛋白形成過(guò)程，肺表面蛋白對(duì)維持肺泡表面張力具有重要作用，從而引起肺泡塌陷，肺表面活性蛋白D(surfactant protein-D，SP-D)可以逆轉(zhuǎn)這種作用，同時(shí)它也可以減少LPS引起的NETs形成[21]。

3.3 其他

血必凈是一種傳統(tǒng)中藥制劑，注射使用是治療膿毒癥的一種方法，其中3個(gè)主要活性成分包括：紅花黃色素A(safflor yellow A (SYA))、羥基紅花黃素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)和無(wú)水紅花黃素B(nhydrosafflor yellow B，AHSYB)。用腹腔內(nèi)注射LPS來(lái)形成小鼠急性肺損傷模型，然后給予SYA、HSYA和AHSYB 3種物質(zhì)進(jìn)行治療。病理組織學(xué)的結(jié)果提示，SYA、HSYA和AHSYB都可不同水平地減輕肺損傷程度。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，這3種物質(zhì)還顯著減少了髓過(guò)氧化物酶(MPO)和組蛋白，降低了血漿中MPO-DNA復(fù)合物的水平。用PMA刺激HL-60細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，也顯示了類似的趨勢(shì)，3種成分抑制了PMA誘導(dǎo)的類中性粒細(xì)胞HL-60細(xì)胞釋放NETs。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)SYA、HSYA和AHSYB處理后，LPS刺激小鼠和PMA處理的HL-60細(xì)胞中Raf激酶、絲裂原活化蛋白激酶ERK激酶(MEK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化均顯著降低。因此血必凈的3種成分SYA、HSYA、AHSYB對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷和NETs釋放均有保護(hù)作用[22]。

有氧運(yùn)動(dòng)作為一種鍛煉方式，它能夠減輕急性肺損傷時(shí)的肺部炎性反應(yīng)程度，主要通過(guò)參與ERK1/2和NF-κB通路，抑制過(guò)量NETs釋放，減少肺泡巨噬細(xì)胞的促炎極化，從而減輕在急性肺損傷時(shí)的炎性反應(yīng)[23]。

4 問(wèn)題與展望

研究者們經(jīng)過(guò)近50年的探索，急性呼吸窘迫綜合征的機(jī)制研究業(yè)已獲得了重大的突破，但是目前仍然沒(méi)有研制出有效的治療藥物，病死率依然居高不下。NETs在它的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，近年來(lái)成為了研究熱點(diǎn)，NETs可能成為一種新的治療方向。NETs對(duì)機(jī)體也有一定的保護(hù)作用，可以包裹殺滅病原體，然而，如果完全阻斷生成或者其作用，可能會(huì)影響人體的免疫水平，因此尋找一個(gè)平衡點(diǎn)，應(yīng)是未來(lái)研究的方向。