婦安消疹洗液對特應性皮炎模型小鼠的療效實驗*

陳 芳，景海霞，馬朝暉，陳少秀，常明泉

（湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

強烈的瘙癢感是特應性皮炎的典型特征之一［1］。引起特應性皮炎的外在因素包括環(huán)境、飲食、光照等，內(nèi)在因素包括免疫功能異常、遺傳、精神等［2］。目前，主要采用抗生素、糖皮質激素治療特應性皮炎，但耐藥性、藥物依賴性等副作用明顯。婦安消疹洗液是湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院研發(fā)的外用制劑，具有抗菌消炎、止癢、抗變態(tài)反應作用［3］，目前主要用于治療婦科陰道炎，以及皮膚科手汗皰疹、濕疹。本研究中探討了婦安消疹洗液對特應性皮炎模型小鼠的療效，以及外用治療特應性皮炎的方法及作用機制，為安全、合理、有效用藥提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器:XTDP1500 型激光共聚焦掃描顯微鏡（皮膚CT，新拓三維技術＜深圳＞有限公司，波長830 nm）；TGL-16G 型臺式離心機（上海安亭醫(yī)療器械公司，轉速為16 000 r/min）；UV1901 型紫外分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；FST 型耳打孔器（北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司，范圍6 ～11.5 mm）；ZR-08 型小鼠固定器（上海普辛儀器科技有限公司）；GL12A1-1SCN 型天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）。

試藥:婦安消疹洗液（醫(yī)院制劑，規(guī)格為每瓶250 mL，生藥0.672 g/mL）；鹵米松乳膏（香港澳美制藥廠，規(guī)格為 每 支1 g ∶0.5 mg，批 號 為20180410）；干 擾 素γ（IFN-γ，批號為20190411），白細胞介素4（IL-4，批號為20190411），白細胞介素5（IL-5，批號為20190623），免疫球蛋白E（IgE，批號為20190513），酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號為20190922），均購于上海臻科生物科技有限公司；二硝基氯苯（DNCB，批號為20181206，化學純）；0.9%氯化鈉溶液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為2.25 g ∶250 mL，批號為U18090604-4）；丙酮（武漢中天化工有限公司，批號為20180916，化學純）；十二烷基硫酸鈉（蘇州同豐化工有限公司，批號20180412，化學純）。婦安消疹洗液由野菊花（批號為20181106）、苦參（批號為20190302）、白礬（批號為20180614）、土茯苓（批號為20190524）、漏蘆（批號為20190422）、蛇床子（批號為20180716）組方，均購于湖北清大藥業(yè)有限公司。

動物:SPF 級C57BL/6/ICR 健康小鼠48 只，體質量25 ～30 g，6 周齡，雌雄各半，來源于湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心，生產(chǎn)許可證［SCXK（鄂）2016-0008］，使用許可證［SYXK（鄂）2016-0031］，飼養(yǎng)條件為溫度20 ～24 ℃，相對濕度40% ～70%，試驗過程中供給專用飼料及飲水，試驗期間小鼠自由進食、飲水，并按試驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 試驗方法

分組、造模［4］與給藥:將48 只健康小鼠分為6 組，即正常組（A 組）、模型組（B 組）、對照組（C 組，鹵米松乳膏），以及婦安消疹洗液低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，生藥0.334，0.672，1.344 g/mL），每組8 只，均規(guī)范飼養(yǎng)7 d。試驗前1 d，用電動剃須刀剃去小鼠背部及雙側耳廓毛發(fā)，面積為2 cm2。第0 ～2 天，在A 組小鼠背部剃毛處涂抹不含DNCB 的丙酮溶液100 μL，在B 組、C 組、D1組、D2組、D3組小鼠背部剃毛處涂抹1% DNCB 丙酮溶液100 μL 致敏；第3 ～7 天第不作任何處理；第8 ～16 天，先用4%十二烷基硫酸鈉溶液清潔小鼠背部和耳部剃毛處，待干燥，A 組小鼠給予不含DNCB 的丙酮溶液100 μL，B 組、C 組、D1組、D2組、D3組小鼠背部剃毛處給予0.5% DNCB 丙酮溶液100 μL再次致敏，左耳廓部給予0.5% DNCB 丙酮溶液25 μL致敏，至小鼠皮膚表皮出現(xiàn)剝脫、出血、滲出、紅斑、結痂，耳朵明顯腫脹視為造模成功。D1組（取婦安消疹洗液250 mL 加純化水500 mL，按1 ∶2 稀釋，搖勻，即得含生藥0.334 g/mL 的洗液），D2組（含生藥0.672 g/mL的洗液），D3組（取婦安消疹洗液500 mL，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至250 mL，即得含生藥1.344 g/mL 的洗液）所用藥液，均由湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院中醫(yī)藥研究所臨時制備。造模成功24 h 后，A 組和B 組涂抹生理鹽水0.05mL/cm2，C 組小鼠涂抹鹵米松乳膏0.05g/cm2，D1組、D2組、D3組小鼠分別涂抹相應濃度洗液0.05 mL/cm2。每日1 次，均持續(xù)給藥7 d。

1.3 觀察指標［5-7］

皮損變化:每次給藥前，注意觀察特應性皮炎皮損部位的變化，包括表皮剝脫、出血消失、滲出消失、紅斑變淺、結痂減少的時間。

免疫指標水平:最后1 次給藥24 h 后，用注射器從小鼠眼眶取靜脈血漿，抗凝處理后在4 ℃環(huán)境下離心（2 000 r/min）30 min，取血清，儲存于-20 ℃冷凍箱中，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠免疫功能指標（IFN-γ，IL-4，IL-5，IgE）水平。

病理生理變化:最后1 次給藥24 h 后，取已抽取眼眶靜脈血漿后的各組小鼠，在共聚焦掃描顯微鏡下準確定位測定皮損厚度，記錄測定結果；處死測定皮損厚度后的小鼠，左右耳對應部位分別用直徑為6 mm 的打孔器打取相同面積的耳片，稱取雙耳片質量，計算耳腫脹度；摘取胸腺和脾腺，分別稱取質量，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；切取打孔的左耳部分耳片于中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋制成4 μm 厚度組織切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色后在光學顯微鏡下觀察淋巴細胞浸潤、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞的數(shù)目變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 皮損情況

與B 組比較，C 組、D2組、D3組小鼠表皮剝脫停止、出血消失、滲出消失、紅斑變淺、結痂減少時間均顯著縮短，且皮損改善程度呈劑量依賴性變化（P ＜0.05）；D1組與B 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠皮損癥狀改善情況（± s，d）Tab.1 Improvement of skin lesion symptoms of mice in each group（± s，d）

表1 各組小鼠皮損癥狀改善情況（± s，d）Tab.1 Improvement of skin lesion symptoms of mice in each group（± s，d）

注:與B 組比較，＃P ＜0.05。下表同。-為未出現(xiàn)。Note:Compared with those in group B，＃ P ＜0.05，as well as the following tables. -indicates that it does not appear.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組剝脫停止-5.5±2.4 2.2±1.4＃4.3±2.1 2.4±1.1＃2.1±0.7＃出血消失-3.1±0.8 1.3±0.6＃2.6±0.5 1.5±0.4＃1.2±0.4＃滲出消失-6.1±3.3 3.7±1.3＃4.9±2.4 3.4±1.2＃3.3±1.1＃紅斑變淺-6.5±3.2 5.1±2.4＃6.2±2.7 5.2±2.5＃4.0±2.5＃結痂減少-6.5±3.1 4.4±2.8＃5.7±2.5 4.4±2.1＃4.1±1.8＃

A 組小鼠左耳皮損處有少量淋巴細胞浸潤；與B 組比較，D2組、D3組小鼠皮損炎性細胞計數(shù)均顯著減少（ P ＜0.05）；D1組小鼠炎性細胞計數(shù)與B 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。詳見圖1。

圖1 各組小鼠炎性細胞浸潤圖（HE 染色，4×10）Fig.1 Diagram of Inflammatory cell of mice in each group（HE staining，4 ×10）

2.2 免疫指標水平

與A 組比較，B 組小鼠IFN-γ 水平顯著降低，IL-4，IL-5，IgE 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，D2組、D3組小鼠IFN-γ 水平均顯著升高，D1組、D2組、D3組小鼠IL-4，IL-5，IgE 水平均顯著降低（P ＜0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠免疫指標檢測結果（± s，pg/mL，n ＝8）Tab.2 The Levels of immune indexes of mice in each group（± s，pg/mL，n ＝8）

表2 各組小鼠免疫指標檢測結果（± s，pg/mL，n ＝8）Tab.2 The Levels of immune indexes of mice in each group（± s，pg/mL，n ＝8）

注:與A 組比較，△P ＜0.05，*P ＜0.01；與B 組比較，＃P ＜0.05。表3 同。Note:Compared with those in group A，△P ＜ 0.05， * P ＜ 0.01；compared with those in group B， ＃P ＜0.05；as well as Tab.3.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組IFN-γ 24.8±4.6 15.3±3.7△21.8±4.5 18.4±3.8 21.5±3.5＃23.3±4.6＃IL-4 8.7±1.6 37.7±4.7*16.5±2.4 29.6±3.9＃19.4±2.6＃15.7±2.9＃IL-5 15.1±1.5 52.4±3.3*27.9±1.7 43.8±2.4＃28.1±2.0＃26.1±2.1＃IgE 12.2±5.3 161.1±49.3*77.6±17.2 138.7±48.9＃73.6± 29.0＃69.3± 25.8＃

2.3 病理生理變化

與A 組比較，B 組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、皮損厚度均顯著升高（ P ＜0.01）；與B 組比較，D2組、D3組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、皮損厚度均顯著降低（P ＜0.05），且呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 各組小鼠病理生理指標檢測結果（± s，n ＝8）Tab.3 Results of pathophysiological indexes of mice in each group（± s，n ＝8）

表3 各組小鼠病理生理指標檢測結果（± s，n ＝8）Tab.3 Results of pathophysiological indexes of mice in each group（± s，n ＝8）

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組耳腫脹度（mg）0.878±0.301 23.614±5.512*15.534±2.303 19.761±3.341 15.355±2.602＃13.968±2.145＃胸腺指數(shù)（mg/g）1.177±0.281 2.423±0.526*1.445±0.269 2.297±0.321 1.437±0.383＃1.431±0.323＃脾臟指數(shù)（mg/g）1.533±0.572 3.745±0.467*2.899±0.325 3.552±0.288 2.634±0.356＃2.324±0.317＃皮損厚度（μm）65.5±6.9 655.6±39.5*534.4±32.4 638.2±37.9 537.7±30.3＃506.9±23.0＃

3 討論

特應性皮炎的發(fā)生多伴有變態(tài)反應、細菌感染、外界環(huán)境刺激、體內(nèi)毒素過多分泌等，其免疫指標主要有血清中的IgE 和IFN-γ。特應性皮炎小鼠血清中IgE水平與炎癥的嚴重程度呈正相關，與IFN-γ 水平呈負相關［8-9］，癥狀加重，則IgE 水平升高，IFN-γ 水平降低；癥狀減輕，則IgE 水平降低，IFN-γ 水平升高。IFN-γ 對IgE 具有抑制作用。IL-4 是合成IgE 的主要物質，IL-5 是IL-4 合成IgE 的協(xié)同因子。故IFN-γ，IgE，IL-4，IL-5 水平的表達量對評估特應性皮炎的療效具有重要參考意義。

婦安消疹洗液中主要含有菊花苷、苦參堿、蛇床子素、黃酮、花椒毒酚、十二水合硫酸鋁鉀、落新婦苷、噻吩類、萜類等活性物質［10-15］。菊花苷、黃酮、萜類物質對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等抑菌力強，用于小鼠皮損部位有益于抑制感染；苦參堿抗炎止癢、抗過敏，發(fā)揮抑制小鼠耳腫脹、胸腺、脾腫脹的效果；蛇床子素的抗變態(tài)反應作用突出，可消除小鼠的過敏反應，同時具有浸潤麻醉作用；花椒毒酚抗炎止癢作用強，對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌等皮損部位的易感菌具有抑制作用，對末梢神經(jīng)的抑制作用可阻滯DNCB 誘導的瘙癢向小鼠大腦中樞傳遞；十二水合硫酸鋁鉀具有解毒殺蟲、燥濕止癢、抑菌作用，收斂防腐作用還可抑制小鼠皮損部位出血及炎性滲出，減少皮損剝脫，促使其出血和滲出液干涸，使皮損部位結痂愈合；落新婦苷具有選擇性免疫抑制作用，對特應性皮炎小鼠的遲發(fā)型超敏反應產(chǎn)生抑制作用，能否選擇性抑制活化的Th1細胞而不影響Th2細胞需要進一步研究；噻吩類物質除濕消癰，抗炎，改善外周微循環(huán)，可活化小鼠皮損部位的細胞因子，促進其游走，從而對小鼠因DNCB 導致的紅斑、結痂、皮損肥厚產(chǎn)生消融、修復作用。

本研究結果顯示，給藥后，小鼠的表皮剝脫、出血、炎性滲出、紅斑、結痂等癥狀均得到有效改善，隨著皮損癥狀的改善，炎癥得到控制，皮下組織、皮膚屏障功能逐漸恢復，小鼠外周免疫系統(tǒng)功能逐漸恢復，表現(xiàn)為IFN -γ 水平升高。同時，降低了IL -4，IL -5，IgE 水平。給藥7 d 后，D2組、D3組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、皮損厚度均顯著低于B 組。婦安消疹洗液對特應性皮炎小鼠的皮損、免疫指標、病理生理指標均有正向改善作用，其他作用機制有待進一步探討。

綜上所述，婦安消疹洗液具有消炎、抗變態(tài)反應的作用，對特應性皮炎模型小鼠的療效顯著。