中國人群肝功能檢測指標全基因組關聯分析研究

孫一丹，田子釗，周偉，李沫，懷聰，賀林，秦勝營

研究報告

中國人群肝功能檢測指標全基因組關聯分析研究

孫一丹，田子釗，周偉，李沫，懷聰，賀林，秦勝營

上海交通大學Bio-X研究院，上海 200030

肝功能檢測(liver function test, LFTs)指標是受遺傳和環境影響的復雜性狀，具有個體差異性。為系統性研究中國人群全基因組范圍內單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)與肝功能指標之間的聯系，本研究利用英國生物銀行(UK Biobank)中1653名中國人的基因分型數據和表型數據為研究對象，利用PLINK軟件進行全關聯分析研究(genome-wide association study, GWAS)，發現229個SNP與中國人群血液中的總膽紅素(total bilirubin, TB)相關，27個SNP與中國人群血液中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)相關，36個SNP與中國人群血液中的γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)相關，1個SNP與中國人群血液中的門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase, AST)相關，最顯著的位點中有11個位點是新的LFTs關聯位點。通過功能基因組分析，發現這些位點的臨床意義(如吉爾伯特綜合征)，確定了候選基因(,,)，為從遺傳角度理解中國人群LFTs的個體差異性和肝功能指標臨床精準檢測提供了前期研究基礎。

肝功能檢測；總膽紅素；堿性磷酸酶；γ-谷氨酰轉肽酶；全基因組關聯分析

肝功能檢測(liver function test, LFTs)是臨床上常見的檢測肝病的手段，其中血清酶活性測定在臨床上被用于檢測肝損傷[1]：當肝臟發生炎癥或其他損傷時，肝細胞代謝異常、細胞膜的通透性改變，導致肝酶釋放進入血液，因此通過檢測血清中的肝酶和膽紅素等指標可以評估肝臟受損程度和肝病的嚴重程度[2]。LFTs是檢測藥物性肝損傷的臨床一線指標，通常也可以指示多器官復雜疾病——在心腦血管疾病，糖尿病，或代謝綜合征中能觀察到血清中肝酶活性的異常[3~5]。常見的LFTs指標包括：丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)，門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase, AST)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)，γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)，膽紅素(bilirubin)等[2]。但是有研究表明，即使是同一個人，LFTs在短期內也會存在差異，超過30%的第一次檢測出異常結果的成年人在重新進行LFTs后，肝酶和膽紅素水平被重新歸類為正常[6]。

LFTs的檢測指標——肝酶和膽紅素是受多基因和環境因素決定的復雜性狀。其中，環境因素包括年齡、性別、飲食習慣、身體質量指數(body mass index, BMI)、吸煙、飲酒等[7]；而國內外的眾多研究也提示了基因多態性對肝功能指標的影響。一項基于丹麥雙生子的研究發現ALT、GGT和膽紅素等肝功能指標具有高遺傳力(35%~61%)，且這些指標的遺傳力獨立于飲酒和BMI等環境因素[8]。幾項全基因組關聯研究(genome-wide association studies, GWAS)也發現了與外周血中肝酶和膽紅素水平相關的基因，如影響GGT水平，與ALP水平相關，和可能影響ALT，與膽紅素相關，與AST和ALT有關。同時，這些基因對肝功能指標的影響呈現明顯的種族差異 性[5,9,10]。中國是肝臟疾病的高發地區，為了更好地使用LFTs指標輔助疾病診斷，有必要加深對影響肝功能指標的非疾病因素的理解，因此深入研究影響中國人群的肝功能指標的遺傳特征非常重要。本研究利用英國生物銀行(UK Biobank)中的中國人基因分型數據進行全基因組關聯分析研究，旨在評估中國人群中與肝功能指標相關的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)風險位點。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

本研究入組了UK Biobank[11]中的1653名中國人，經申請，獲得了他們的基因信息和表型信息，申請號為(Application 34716)。基因型由UK Biobank通過Affymetrix UK BiLEVE Axiom和Affymetrix UK Biobank Axiom兩種芯片獲得超過800,000個SNP，覆蓋率超過95%[12]。表型信息包括電子病歷所記錄的患病史和血液生化指標檢測等。

1.2 表型分析

通過表型信息對樣本進行篩選，排除了患有肝膽疾病的病例，包括ICD10和ICD9編碼的肝病和參與者自我報告的肝病，這些疾病包括：酒精性肝病、肝衰竭、慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、病毒性肝炎、肝癌等。最后篩選獲得1508名無肝病史的中國人入組本研究。

1.3 數據分析

從UK Biobank獲取SNP基因分型數據后，使用PLINK (version1.9, http://www.pngu.mgh.harvard. edu/purcell/plink/)軟件對數據進行質控，質控標準為去除缺失率大于5%、哈迪–溫伯格平衡(hardy- Weinberg equilibrium, HWE)值偏離1.00×10–6、最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)小于1%的SNP；使用Minimac4 (https://imputationserver. sph.umich.edu/)對數據進行基因型填充(參考單倍型為1000 Genomes Phase 3東亞人群)。填充結果用PLINK對數據進行質控，質控標準為除缺失率大于1%、雜合率偏離3倍的標準差、HWE值偏離1.00×10–6的樣本；將通過質控的樣本與1000人基因組樣本(1000 Genomes Phase 3)一同進行多維尺度分析(multidimensional scaling, MDS)來對人群分層進行可視化[13]，通過主成分分析(principal com-ponents analysis, PCA)去除偏離整體目標群體的游離樣本，去除重復和具有親緣關系的樣本。選取通過質控的樣本的常見變異(MAF > 1%)后進行卡方關聯分析(含Bonferroni矯正)，和線性模型矯正協變量的關聯分析，協變量矯正(年齡、性別、吸煙)[14,15]，其中協變量包括PCA的前六個主成分、年齡、性別、吸煙和飲酒。使用R軟件qqman包繪制經協變量矯正后的關聯分析的曼哈頓圖和QQ圖，使用Locus Zoom (http://locuszoom.org/)繪制LocusZoom圖展示顯著SNP附近的局部信息[16]。將得到的易感SNP (<5.00×10–8)使用VarNote (http://mulinlab.org/varnote/ index.html)進行注釋[17,18]，在ClinVar (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)數據庫中查詢易感SNP的臨床數據，在RegulomeDB (https://www.regulomedb. org/regulome-help/)中對SNP進行功能基因組學打分，估算SNP的調控能力[19]。使用SMR (https:// cnsgenomics.com/software/smr/)在GTEx數據庫中查詢SNP在肝中的數量表達性狀位點信息(expression quantitative trait loci, eQTL)[20]。

2 結果與分析

2.1 中國人群篩選和芯片數據質控結果

在UK Biobank共獲取1508名未患肝病的中國人的肝功能指標數據，其中1482個樣本有基因分型數據，經PLINK質控共得到784,256個SNP位點進行填充。使用Minimac4進行填充后共獲得6,977,555個SNP位點。使用PLINK軟件對填充過后的位點進行質控，并與1000人基因組樣本進行MDS分析，大部分樣本與東亞血統重合，但也有少部分可能為歐美血統(圖1 A)，根據PCA分析保留東亞血統后，MDS分析結果顯示已去除可能具有歐美血統的樣本，剩余樣本全部為東亞血統(圖1 B)。最終得到1361人，6,906,867個SNP分型結果。樣本雜合率偏離均值不超過3倍的標準差，無親緣關系(IBD> 0.1875)；SNP位點缺失率小于5%，檢出率大于99%，HWE值大于1.00×10–6，MAF大于1%。

2.2 全基因組關聯分析篩選差異位點

使用PLINK軟件對6,906,867個SNP進行卡方關聯分析，通過Bonferroni矯正，觀察到了與總膽紅素(total bilirubin, TB)水平相關的228個易感SNP (<0.05)；最顯著的易感SNP為rs1983023、rs6431625、rs2018985和rs4477910 (=3.89×10–38)，位于已報道的膽紅素相關調控基因基因簇區域內[5]；觀察到了與ALP水平相關的28個易感SNP(<0.05)，其中最顯著的易感SNP為rs550057、rs579459、rs651007、rs507666、rs600038和rs532436 (=8.27×10–5)，位于已報道過的ALP相關調控基因內[7]。觀察到了與GGT水平相關的36個易感SNP (<0.05)，其中最顯著的易感SNP為rs5760500，位于已報道過的GGT相關調控基因內[10]。未觀察到經Bonferroni矯正后的AST和ALT卡方關聯分析顯著結果。

由于肝功能指標為連續變量，因此使用PLINK軟件對這些位點用線性回歸模型進行協變量矯正后的全基因組關聯分析。將套用線性模型且經協變量矯正后進行GWAS，觀察到與TB相關的229個SNP達到全基因組顯著(<5.00×10–8)，rs1983023、rs6431625、rs7576166、rs4477910和rs2018985最為顯著(=4.07×10–44)。；觀察到與ALP相關的27個SNP達到全基因組顯著(<5.00×10–8)，rs2519093最為顯著(=1.18×10–10)；觀察到與GGT相關的36個SNP達到全基因組顯著(<5.00×10–8)，rs5760500最為顯著(=7.80×10–11)；觀察到與AST相關的1個SNP達到全基因組顯著(<5.00×10–8)，為rs150693807 (=1.34×10–8)。QQ圖證明全基因組范圍內存在大量SNP與TB (圖2 A)，ALP (圖2 B)，GGT (圖2 C)和AST (圖2 D)有顯著的相關性。曼哈頓圖(圖3)顯示了經矯正后的關聯分析結果，依然在2號染色體上發現了具有全基因組顯著性的SNP與TB水平相關(圖3 A)，在9號染色體上發現具有全基因組顯著性的SNP與ALP水平相關(圖3 B)，在3號和22號染色體上發現了具有全基因組顯著性的SNP與GGT水平相關(圖3 C)，在2號染色體上發現了具有全基因組顯著性的SNP與AST水平相關(圖3 D)。在兩項研究中，人群分層得到了矯正，觀察到了較低的膨脹系數(λTB=1.01, λALP=1.00, λGGT=1.01, λAST=1.01)。LocusZoom圖(圖4)展示了具有全基因組顯著性的SNP附近位點，并且注釋了這些SNP所處的基因。

圖1 多維尺度分析顯示的群體結構圖

A：質控前MDS結果；B：質控后MDS結果。綠圈為歐洲血統，紅圈為東亞血統，粉圈為美洲血統，藍圈為非洲血統，加號為本課題樣本。

圖2 中國人群肝功能檢測指標的Q-Q圖

A: TB-GWAS; B: ALP-GWAS; C: GGT-GWAS; D: AST-GWAS。

圖3 中國人群肝功能檢測指標的曼哈頓圖

A: TB-GWAS; B: ALP-GWAS; C: GGT-GWAS; D: AST-GWAS。

圖4 中國人群肝功能檢測指標關聯區段局部圖

A：TB-GWAS 2號染色體；B：ALP-GWAS 9號染色體；C：ALP-GWAS 8號染色體；E：GGT-GWAS 22號染色體；F：GGT-GWAS 3號染色體；G：AST-GWAS 2號染色體。紫色菱形為最顯著SNP位點，灰色圓點為SNP位點，藍色曲線為重組率，下方為注釋基因箭頭表示轉錄方向。

2.3 相關位點功能分析

在VarNote中進行SNP和基因的注釋，在ClinVar查詢所有達到全基因組顯著SNP (<5.00× 10–8)的臨床信息，結果如表1所示。共獲得與TB相關的4個SNP存在臨床意義，包括與藥物反應相關，是吉爾伯特綜合征、Lucey-Driscoll綜合征和Crigler-Najjar綜合征的風險位點；獲得了和與ALP相關的1個SNP存在臨床意義，與血型相關。

在RegulomeDB中對所有達到全基因組顯著SNP (<5.00×10–8)進行調控能力的打分，共獲得與TB相關的12個SNP，與ALP相關的3個SNP，和與GGT相關的3個SNP具有80%以上的可能性為調控SNP，其所在基因和區域如表2所示，證明了基因簇與TB、與ALP、與GGT之間的關系。除此之外還發現了一個的同義突變(rs13009407)與TB相關。

使用SMR在GTEx數據庫中查詢到39個與TB相關的SNP影響了在肝組織中的表達(<1.00×10–5)。

3 討論

LFTs常用來評估肝功能和疾病，血液中高水平肝酶和膽紅素與多種疾病相關，如黃疸，吉爾伯特綜合征和多種傷害引起的肝損傷，包括酒精濫用，病毒感染，自身免疫，藥物毒性和代謝綜合征等[21,22]。藥物引起的肝損傷是常見的藥物不良反應，肝功能異常也是終止臨床治療的常見原因，2019年中華醫學會結核病學分會出臺的抗結核藥物診療指南也根據血清中的ALP、ALP和TB對肝損傷進行診斷和嚴重程度分級[23,24]。但在對正常人進行血液生化指標常規檢查時，也會出現錯誤檢測出異常值的情況[6]。除了受環境影響外，所有的肝功能指標都有顯著的遺傳基礎，了解肝功能指標的潛在遺傳貢獻有助于解釋個體之間的廣泛差異[25]。盡管已有相關基因報道，但人種之間遺傳特征不同。如未在東亞人群中重復出之前歐洲人種中發現的與ALP相關的、、、和[7]。本研究對UK Biobank中的中國人群進行全基因組關聯分析，確定了在中國人群中與LFTs相關的293個SNPs，并且查詢了所有達到全基因組顯著位點的臨床意義，預估其調控能力，查詢其eQTL信息，旨在尋找影響中國人LFTs的潛在遺傳標記。

表1 中國人群肝功能指標相關位點臨床意義

Ref：原始堿基；Alt：突變堿基。

表2 中國人群肝功能指標相關位點調控能力預測結果

續表

Ref：原始堿基；Alt：突變堿基。評分，范圍為0~1，越接近1，該位點為調控SNP的可能性越大。

膽紅素是血紅素分解的最終產物，血清中的膽紅素會因黃疸等疾病升高，并且膽紅素濃度受到基因調控。在歐美人群和東亞人群中，基因座和基因座與血清中的高水平膽紅素相關[5]。本研究所發現的最顯著位點之一的rs2018985在西班牙人群中被證實與TB相關[26]，首次報道了rs1983023、rs6431625、rs7576166和rs4477910與中國人群TB之間的關聯。顯著SNP所在的基因簇編碼UDP-葡糖醛酸糖基轉移酶(UGT)家族，是藥物代謝酶之一[27]，在膽紅素代謝中起到重要作用[28]。該區域包含9個相似的蛋白編碼基因和4個相似的非蛋白編碼基因[29]。其中的遺傳缺陷被證明和高膽紅素相關，而與葡萄糖醛酸化率相關，影響膽紅素代謝[28]。葡萄糖醛酸與膽紅素的結合影響膽紅素代謝，導致血液中存在高膽紅素，例如吉爾伯特綜合征，Crigler-Najjar綜合征，和Lucey-Driscoll綜合征[30]，本研究所發現的rs4148323和rs887829被報道過與中國人群膽紅素水平相關[31]。本研究首次證明了與吉爾伯特綜合征相關的rs4124874和rs35350960也與中國人群膽紅素水平升高有關。除此之外本研究發現的rs13009407是一個同義突變，有研究證明表達的降低與二型糖尿病有關[32]，膽紅素升高與二型糖尿病有密切的聯系[33]。

基因座和血清中的ALP水平之間的關聯已在包括中國人在內的人群中都有報道過，本研究所發現的最顯著的rs579459、rs651007已在歐洲、韓國和日本人人群中報道過[5,21,22]，首次發現了rs550057、rs507666、rs600038、rs532436和rs2519093與中國人群ALP之間的關聯。基因編碼糖基轉移酶，其催化活性有助于形成血型的抗原結構[34]。基因表達與ALP水平之間的關系尚不明確，本研究所發現的rs1053878與A型血的一個亞型相關[35]，rs550057、rs532436和rs600038都有可能調控基因的表達，因此推測ALP水平可能與不同血型同工酶變化有關。雖然發現8號染色體上發現了一個ALP相關的SNP，但經注釋rs143653948位于基因間區。

參與谷胱甘肽的代謝，是最常見的GGT相關基因[5]。本研究首次發現了rs5760500與中國人群GGT之間的關聯，rs2073398、rs2003757和rs5751904可能具有調控的作用。本研究還發現在3號染色體上的rs9846667與GGT相關，位于內含子區域，但該基因在大腦高度表達[36]。與AST相關的rs150693807，經注釋位于基因間區，并未查詢到其相關臨床信息和調控作用。并未發現達到全基因組顯著的與ALT相關的位點。

本研究的優勢之一是使用UK Biobank所收集的中國人群基因分型數據和電子病歷中的肝功能數據進行關聯分析，分析結果復現了既往研究中的顯著SNP、基因的同時也得到新的發現，TB與的關聯、ALP與的關聯、GGT和的關聯和之前的研究高度一致，證明了電子病歷記錄數據的有效性和價值。數據共享和生物銀行的重要性在全球衛生研究中日益到認可，雖然這些項目在分析過程中需要進行更為精細地處理，如人群分層，但生物銀行的建立無疑將為疾病的診斷、預防和治療提供強大的研究資源。若能建立中國人群為主的數據庫，必將極大推進中國人群的健康研究。

綜上所述，本研究通過對1653名中國人群進行肝功能指標的全基因組關聯分析的系統性研究，發現rs1983023、rs6431625、rs7576166和rs4477910與中國人群TB最為相關，發現rs550057、rs507666、rs600038、rs532436和rs2519093與中國人ALP水平最為相關，發現rs5760500與中國人GGT水平最為相關，發現rs150693807與中國人AST水平最為相關，同時結合顯著位點的臨床意義、eQTL和調控能力為解釋肝功能指標的個體差異性和在臨床上檢測肝功能指標提供了前期研究基礎。

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Genome-wide association study on liver function tests in Chinese

Yidan Sun, Zizhao Tian, Wei Zhou, Mo Li, Cong Huai, Lin He, Shengying Qin

Liver function tests (LFTs) measure a series of complex traits that are affected by genetic and environmental factors. Previous studies demonstrated that there exist significant differences in LFTs across individuals, which may be the results of the unique genetic profile of each individual. Therefore, we performed a genome-wide association study (GWAS) to evaluate the influence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in LFTs and identify the significant association between genotypes and phenotypes using 1653 Chinese subjects from the UK Biobank database. We successfully identified 229 SNPs significantly associated with total bilirubin (TB) levels, 27 SNPs significantly associated with alkaline phosphatase (ALP), and 36 SNPs significantly associated with γ-glutamyl transpeptidase (GGT) in serum. In addition, one SNP significantly associated with aspartate transaminase (AST) in serum was also found. Among the most significant ones, the topmost 11 SNPs were found to be associated with LFTs for the first time. Through functional genomic analysis, the clinical significance of these SNPs could be associated with diseases (e.g. Gilbert's syndrome) and the respective candidate genes (,,). This study provides a preliminary rationale for research to understand the associations of individual genetic differences and clinical liver functions in the Chinese population.

Liver function tests; total bilirubin; alkaline phosphatase; γ-glutamyl transpeptidase; genome-wide asso-ciation study

2020-12-16;

2021-02-01

國家自然科學基金項目(編號：81773818，82003856)資助[Supported by the National Nature Science Foundation of China (Nos. 81773818, 82003856)]

孫一丹，在讀碩士研究生，專業方向：生物學。E-mail: yidan_sun@sjtu.edu.cn

秦勝營，教授，研究方向：藥物基因組學與個體化醫學。E-mail: chinsir@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-435

2021/3/5 17:27:10

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210305.0938.002.html

(責任編委: 周鋼橋)