雞原始生殖細胞轉染條件優化

鄒嫻，何燕華，何靜怡，王艷，舒鼎銘，羅成龍

技術與方法

雞原始生殖細胞轉染條件優化

鄒嫻，何燕華，何靜怡，王艷，舒鼎銘，羅成龍

廣東省農業科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640

為獲得雞原始生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)的最佳轉染效率，本研究比較不同質粒用量和不同細胞數在3種轉染試劑(Lipofectamine 2000、3000和LTX & Plus Reagent)中PGCs的轉染效率，利用熒光激活細胞分選技術(fluorescence activated cell sorting technology, FACS)輔助優化Lipofectamine 3000轉染試劑，經FACS進一步分選獲得帶綠色熒光蛋白(GFP)的PGCs，繼續培養3周后，移植回注到受體雞胚中，移植3.5 d后分離性腺拍照觀察。結果顯示，轉染試劑Lipofectamine 3000的轉染效率最高，質粒、Lipofectamine 3000轉染試劑和PGCs細胞數的配比為3 μg: 4 μL: 0.5×104個，轉染5 h轉染效率最高，達到23.4%，與現有的研究結果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受體雞胚中，熒光顯微鏡觀察到雞胚性腺中有GFP陽性細胞。本研究綜合考慮轉染試劑、質粒用量和細胞數量的影響因素以優化PGCs的轉染條件，為高效制備轉基因雞及基因編輯雞的研究奠定基礎。

雞；原始生殖細胞；穩定轉染；脂質體

雞()已被廣泛用于早期胚胎發生、毒理學和干細胞等研究，特別是鳥類轉基因和基因組編輯研究[1,2]。原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)是精原細胞和卵原細胞的祖先細胞，能將遺傳信息傳遞給下一代。雞PGCs經過體外培養及基因修飾后，仍保持其生物學特性，移植回注到雞胚血脈系統后可遷移到性腺并發育成功能性配子，產生轉基因后代[3]。近年來，CRISPR/Cas9技術的發展及應用，使基因編輯鳥類模型成為可能，包括將LOXP位點導入雞IgH位點、靶向卵球蛋白基因、標記基因插入Z染色體和抗J亞型禽白血病雞模型[4~7]。但是，在利用雞PGCs為載體進行基因操作過程中，需經歷基因克隆、細胞轉染、PGCs移植等步驟，而細胞轉染技術則是此過程中的重要環節。目前雞PGCs轉染技術主要有脂質體轉染、腺病毒或慢病毒轉染和電轉染，其中脂質體轉染技術因其安全、操作簡便、成本低而應用較多。但雞PGCs脂質體轉染效率較低(約5%~10%)[8]，限制了其應用。本研究以雞PGCs為模型，用3種不同脂質體轉染試劑(Lipofectamine 2000、3000和 LTX & Plus Reagent)進行轉染，摸索質粒濃度、轉染試劑復合物配比以及細胞數量等，分析轉染效率，旨在優化脂質體轉染試劑介導的PGCs轉染條件。

1 材料與方法

1.1 材料

種蛋為惠陽胡須雞種蛋，來源于廣東省農業科學院動物科學研究所原種雞場。在Rcom PRO 50孵化箱(Rutoex)中38.5℃、相對濕度60%孵化至所需日齡。Bac轉座子和mPB轉座酶質粒由華南農業大學提供；pPB-GFP轉座子質粒由本實驗室構建，內含由pGK啟動子啟動雙基因和表達的片段(圖1)。

圖1 pPB-GFP質粒圖譜

1.2 細胞分離及培養

從孵育至5.5 d的惠陽胡須雞胚性腺分離獲得PGCs，然后接種至經鈷源處理的BRL飼養層上培養，培養箱條件37℃、5% CO2。PGCs培養液中含56% KO-DMEM、30% BRL培養液、7.5%胎牛血清(FBS)、2.5%雞血清、1×GS非必需氨基酸、1×GlutaMAXTM、1×雙抗(青霉素和鏈霉素)、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhFGF)、人干細胞因子(human SCF)。細胞每2 d進行半量換液，每3~4 d傳代1次。從孵育至5.5 d的惠陽胡須雞胚分離獲得胎兒成纖維細胞(chicken embryo fibroblasts，CEF)，培養箱條件為39℃、5% CO2，培養液中含89% DMEM、10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)。

1.3 qRT-PCR驗證分析

利用qRT-PCR驗證多能性基因、、和在PGCs和CEF中的表達量。PCR擴增體系為10 μL，包括5 μL SYBR? Green Master Mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA 和3 μL ddH2O。擴增條件：95℃ 1 min；95℃ 30 s，54~58℃ 30 s，72℃ 1 min，34個循環。參考NCBI中雞相關基因序列，利用Primer 5.0軟件設計擴增引物，作為內參基因，由Sangon Biotech公司合成，引物信息見表1。

表1 用于qRT-PCR檢測的基因引物

1.4 免疫熒光檢測PGCs特征

PGCs鋪到有蓋玻片的24孔細胞培養板中制作細胞爬片，用4%多聚甲醛室溫固定10~15 min，然后Tris base緩沖液(TBS)洗凈；加入適量0.1% TritonX-100，室溫破膜10 min后TBS緩沖液洗凈；10%驢血清室溫孵育20 min；甩去血清，滴加一抗工作液，4℃過夜；次日從4℃冰箱拿出，復溫15 min，TBS緩沖液洗凈，每張切片滴加50 μL熒光二抗(稀釋比均為1∶400)，37℃孵育30 min，TBS緩沖液洗凈(此步驟開始進行避光)；甩去TBS，每張切片滴加50 μL新鮮配置的DAPI (稀釋比為1∶500)，進行熒光染核，室溫孵育10 min，TBS沖洗3次，每次5 min；甩去TBS，用抗熒光淬滅封片劑進行封片，避光保存于4℃，在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 實驗分組與帶綠色熒光蛋白(GFP)質粒的轉染

前期我們在DF1細胞(雞胚成纖維細胞系)中研究發現當轉座子質粒pPB-GFP與轉座酶質粒mPB的比例為3~4∶1時，轉染效率最高。因此，本研究選擇二者比例為3∶1，在PGCs中進行轉染試驗。

轉染前將PGCs轉移到24孔板中，每孔接種103個PGCs。將PGCs隨機分組，即Lipofectamine 2000 (添加質粒和Lipofectamine 2000，用A表示)、Lipofectamine 3000 (添加質粒和Lipofectamine 3000，用B表示)和Lipofectamine LTX & Plus Reagent(添加質粒和Lipofectamine LTX & Plus Reagent，用C表示)。根據轉染試劑說明書做如下分組：A組依質粒劑量及轉染試劑Lipofectamine 2000劑量分為A1 (1 μg: 2 μL)、A2 (3 μg: 2 μL)、A3 (5 μg: 3 μL)和A4 (6 μg: 4 μL)；B組依質粒劑量及轉染試劑Lipofectamine 3000劑量分為B1(1 μg: 2 μL)、B2(1.5 μg: 3 μL)、B3 (3 μg: 4 μL)和B4(5 μg: 6 μL)；C組依質粒劑量及轉染試劑Lipofectamine LTX劑量分為C1 (1 μg: 1 μL)、C2 (2 μg: 2 μL)、C3 (3 μg: 2 μL)和C4 (5 μg: 3 μL)。每小組3個重復。然后按照轉染試劑盒說明進行轉染，轉染6 h后收集細胞，離心，重懸后接種到新的飼養層上，加入新鮮PGCs培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h后用倒置顯微鏡照相并分析。

篩選出較高轉染效率的組別后，提高細胞密度至0.3×104個/孔或0.5×104個/孔，減少轉染時間至5 h，并用含有血清培養基轉染，進一步優化轉染條件。

1.6 流式細胞術分選穩定表達GFP蛋白的PGCs

將細胞接種到T25培養皿中，脂質體方法轉染GFP蛋白質粒。同時以轉染GFP蛋白質粒的DF1細胞作為陽性對照，以未轉染任何質粒的DF1細胞作為陰性對照進行流式細胞分選。上機分選前，制備無菌操作液清洗流式細胞儀(BD FACSAriaII)。分別收集PGCs和DF1細胞到15 mL離心管中，并用PBS懸浮細胞，細胞數要大于106個/mL。分別用陽性和陰性對照DF1細胞設定流式細胞儀的取樣參數和十字門的范圍，再進行PGCs分選。

1.7 陽性PGCs移植受體雞及性腺分離

將PGCs培養液收集到15 mL離心管中，常溫離心，用PBS洗一次，常溫離心，之后加入適量的PBS懸浮細胞，細胞計數。取所需細胞數，加PBS至總體積的90%，然后加入10%臺盼藍，混勻。取2~2.5日齡雞胚，雞蛋尖端處開殼0.5~1 cm，在體視顯微鏡下找到雞胚背主動脈，針斜面向下，沿著血流方向輕輕吹入1~3 μL含有PGCs的溶液，溶液中PGCs總量約為2000個。在開口周圍涂上蛋清，用膜封好開口，待蛋清干了之后，放入孵化箱繼續孵化。

移植注射3.5 d后取出活胚，在體視顯微鏡下用鑷子分離雞胚性腺，置于滴有80 μL PBS的載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 數據處理

熒光顯微鏡下統計每孔綠色熒光PGCs數量，數據用JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC)統計軟件檢驗，進行差異顯著性分析(<0.05為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 PGCs分離培養

本研究共分離40只雞胚，其中有10個雄性PGCs在第3周結束之前細胞數達到5.0×104，被認為已成功建立了品系。這10個PGCs品系均來自單個胚胎。這些細胞呈圓形、邊緣光亮、體積較大、細胞核大等形態特征，通常能看到細胞兩個連在一起或成串，符合PGCs的形態特征(圖2A)。PGCs培養60 d后，qRT-PCR檢測生殖細胞標記基因、、和，結果表明，它們在PGCs中表達量高，在CEF中表達量極低(圖2B)，表明本研究分離的PGCs具有多能性。同時，通過免疫熒光法檢測到幾乎所有PGCs均表達了生殖細胞表面標志蛋白SSEA-1和DAZL (圖2：C~F)。

2.2 PGCs轉染條件的優化

用3種不同轉染試劑轉染攜帶GFP蛋白的Bac轉座子質粒。結果表明，Lipofectamine 3000轉染試劑中B3陽性細胞數最多，高于所有組別；其次是Lipofectamine 3000轉染試劑B2，第三是Lipofectamine LTX & Plus Reagent轉染試劑C3 (表2)。實驗過程中還觀察到Lipofectamine 2000轉染試劑組以及其他兩種試劑的高濃度組B4和C4對PGCs傷害較大，48 h后觀察到大量PGCs死亡。在B3轉染條件基礎上，提高每孔中PGCs細胞數量到0.5×104，并減少轉染時間至5 h，同時加入含有血清培養基，48 h后，在熒光顯微鏡下計數，發現陽性細胞數更多，每孔陽性細胞數超過了1000個。初步判斷此條件下PGCs轉染效率更佳(命名為D1)，即質粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細胞數0.5×104的配比。

2.3 穩定表達GFP蛋白PGCs細胞株的獲得

為了確定最佳轉染條件，根據B3轉染條件和D1轉染條件分別轉染PGCs細胞，72 h后，利用基因表達綠色熒光蛋白，用流式細胞儀進行陽性細胞分選。以未轉染任何質粒的DF1細胞作為陰性對照、轉染GFP蛋白質粒的DF1細胞作為陽性對照。圖3可知，DF1陰性對照組中陽性細胞比例為0% (圖3A)，DF1陽性對照組中陽性細胞比例為46.2% (圖3B)，B3轉染條件下陽性PGCs比例為12.7% (圖3C)，D1轉染條件下陽性PGCs比例為23.4% (圖3D)。

將流式細胞儀分選后的PGCs接種到24孔板繼續培養，狀態良好(圖4)。繼續培養72 h后進行傳代。

圖2 PGCs的分離培養

A：PGCs體外培養3周后的形態特征；B：qRT-PCR檢測、、和基因在PGCs和CEF中表達情況；C：PGCs中生殖細胞表面標志蛋白SSEA-1(綠色熒光)、DAZL蛋白(紅色熒光)的表達；D：PGCs核染色；E ：PGCs中生殖細胞表面標志蛋白SSEA-1蛋白；F：PGCs中生殖細胞表面標志蛋白DAZL蛋白。

表2 不同轉染試劑和不同劑量GFP質粒轉染PGCs后48 h的陽性細胞數(個/孔)

同一列不同字母表示差異顯著(<0.05)。

圖3 流式細胞儀分選陽性PGCs

A：未轉染任何質粒的陰性DF1細胞分選結果；B：轉染了GFP蛋白質粒的DF1細胞分選結果；C：B3轉染條件下陽性PGCs分選結果；D：D1轉染條件下陽性PGCs分選結果。

圖4 穩定表達綠色熒光蛋白的PGCs

A：白光視野；B：綠色熒光視野。由于雞PGCs是懸浮細胞，無法固定，會漂來漂去，導致PGCs并不總在同一平面或同一位置，因此綠色熒光視野下拍攝的PGCs熒光有強有弱，A和B圖并不能完全匹配上。

2.4 雞早期胚胎注射技術生產轉基因雞

陽性PGCs培養3周后，大量細胞繼續表達GFP蛋白，表明基因已穩定整合到PGCs中。把它們注射到2~2.5胚齡的100只受體雞胚中，繼續孵化至5.5~6胚齡，分離性腺，在熒光顯微鏡下觀察到有2只雞胚性腺表達綠色熒光蛋白(圖5)，表明本研究分離、篩選的PGCs能夠在受體雞中繼續發育。考慮到此次注射的PGCs在體外培養時間較長(約200 d)，本文重新分離PGCs并轉染pPB-GFP質粒，流式細胞術分選陽性PGCs，繼續培養3周后注射到200只雞胚中，隨機取了15枚，熒光顯微鏡下觀察到5枚雞胚性腺表達綠色熒光蛋白。經PCR鑒定性腺中基因表達情況，結果表明陽性性腺中可以檢測到基因的表達，而陰性性腺則無法檢測到(圖5E)。

3 討論

雞肉是人類最重要的食物來源之一，也是用于生產藥用蛋白的生物反應器[9]。隨著基因編輯技術的發展，雞胚胎作為發育和細胞生物學的模型有了更多的機遇，但鳥類在基因組編輯技術方面一直落后于哺乳動物[1,10,11]。本研究旨在探究提高雞PGCs轉染效率的方法，為家禽基因組編輯技術的應用奠定基礎。本研究利用Bac轉座子，比較了3種不同轉染試劑的轉染效率，優化了轉染條件，經流式細胞儀分析轉染效率最高達到了23.4%，PGCs回注到雞胚血液中，獲得了表達GFP蛋白的雞胚。Macdonald等[12]利用Bac及Tol2轉座子有效轉染PGCs后回注到雞胚血脈系統，獲得表達GFP蛋白的轉基因雞，Bac的轉染效率為10.5%。陳美娟等[8]利用Bac轉座子轉染PGCs后回注到雞胚血脈系統，獲得表達GFP蛋白的雞胚，轉染效率最高為6.16%。由此可知，本研究中PGCs的轉染效率高于上述研究結果，篩選出的陽性PGCs可以在受體雞胚中繼續發育，為后續開展基因編輯雞的研究奠定了良好基礎。

圖5 含有表達綠色熒光蛋白PGCs的雞胚性腺

A：陰性雞胚性腺(白光視野)；B：陰性雞胚性腺(綠色熒光視野)；C：陽性雞胚性腺(白光視野)；D：陽性雞胚性腺(綠色熒光視野)；E：PCR鑒定陽性性腺。泳道1和2為表達GFP蛋白的性腺，3和4為注射了陽性PGCs但不表達GFP蛋白的性腺，5和6為未注射陽性PGCs的性腺，M為DL2000 Marker。

本研究用脂質體轉染方法轉染PGCs，比較轉染試劑的轉染效率。結果發現，質粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細胞數104的配比時轉染效率最高。據報道，在一定范圍內, 質粒用量和轉染效率成正比，但當DNA加入過量時，轉染效率反而下降，與本研究結果一致[13,14]。本研究還發現，質粒濃度和轉染試劑劑量相同情況下，提高細胞密度，可以提高轉染效率。這可能是由于細胞密度大，細胞間空隙較小，質粒DNA與細胞接觸面多，進入細胞的阻力變小，從而提高轉染水平。Lipofectamine 3000試劑在操作過程中不需要使用無血清、無雙抗培養基，對PGCs后續生長影響較小。另外，在PGCs傳代后第2 d、3 d、4 d時用最優轉染條件進行轉染，發現轉染效率差異不顯著(數據未呈現)，表明PGCs傳代后第2~4 d均可進行轉染試驗。

目前獲得PGCs的方法主要有兩種：一是從孵化2.5 d左右雞胚循環血液中獲得；二是從孵化5 d左右雞胚性腺中獲得。血液和性腺PGCs的細胞生長和特性基本沒有差異，均表現出FGF依賴性的生長速率，且兩種方法獲得的PGCs均能在體外培養并進行基因修飾后產生轉基因雞[3,7,15~21]。本研究從孵化5.5 d雞胚性腺中分離培養PGCs。與循環血液中PGCs相比，使用性腺PGCs的優點是可以從一個胚胎中獲得更多的PGCs，且每個胚胎都更容易發育出許多PGCs，更有效地篩選出具有生殖細胞多能性的PGCs系，以產生胚系嵌合體和轉基因雞。

相比脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000和Lipofectamine LTX & Plus Reagent，Lipofectamine 3000轉染試劑更適用于轉染PGCs，最優轉染條件為：質粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細胞數0.5×104的配比，且可以用有血清有雙抗的培養基。本研究綜合考慮轉染試劑、質粒用量和細胞數量的影響因素以優化PGCs的轉染條件，為高效制備轉基因雞及基因編輯雞的研究奠定基礎。

[1] Chojnacka-Puchta L, Sawicka D. CRISPR/Cas9 gene editing in a chicken model: current approaches and applications., 2020, 61(2): 221–229.

[2] Zhang G, Li C, Li Q, Li B, Larkin DM, Lee C, Storz JF, Antunes A, Greenwold MJ, Meredith RW, ?deen A, Cui J, Zhou Q, Xu L, Pan H, Wang Z, Jin L, Zhang P, Hu H, Yang W, Hu J, Xiao J, Yang Z, Liu Y, Xie Q, Yu H, Lian J, Wen P, Zhang F, Li H, Zeng Y, Xiong Z, Liu S, Zhou L, Huang Z, An N, Wang J, Zheng Q, Xiong Y, Wang G, Wang B, Wang J, Fan Y, Da FR, Alfaro-Nú?ez A, Schubert M, Orlando L, Mourier T, Howard JT, Ganapathy G, Pfenning A, Whitney O, Rivas MV, Hara E, Smith J, Farre M, Narayan J, Slavov G, Romanov MN, Borges R, Machado JP, Khan I, Springer MS, Gatesy J, Hoffmann FG, Opazo JC, H?stad O, Sawyer RH, Kim H, Kim KW, Kim HJ, Cho S, Li N, Huang Y, Bruford MW, Zhan X, Dixon A, Bertelsen MF, Derryberry E, Warren W, Wilson RK, Li S, Ray DA, Green RE, O'Brien SJ, Griffin D, Johnson WE, Haussler D, Ryder OA, Willerslev E, Graves GR, Alstr?m P, Fjelds? J, Mindell DP, Edwards SV, Braun EL, Rahbek C, Burt DW, Houde P, Zhang Y, Yang H, Wang J, Consortium AG, Jarvis ED, Gilbert MT, Wang J. Comparative genomics reveals insights into avian genome evolution and adaptation., 2014, 346(6215): 1311–1320.

[3] van de Lavoir MC, Diamond JH, Leighton PA, Mather-Love C, Heyer BS, Bradshaw R, Kerchner A, Hooi LT, Gessaro TM, Swanberg SE, Delany ME, Etches RJ. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells., 2006, 441(7094): 766–769.

[4] Koslová A, Trefil P, Mucksová J, Reini?ová M, Plachy J, Kalina J, Ku?erová D, Geryk J, Krchlíková V, Lej?ková B, Hejnar J. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus., 2020, 117(4): 2108–2112.

[5] Lee HJ, Yoon JW, Jung KM, Kim YM, Park JS, Lee KY, Park KJ, Hwang YS, Park YH, Rengaraj D, Han JY. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development., 2019, 33(7): 8519–8529.

[6] Dimitrov L, Pedersen D, Ching KH, Yi H, Collarini EJ, Izquierdo S, van de Lavoir MC, Leighton PA. Germline gene editing in chickens by efficient CRISPR-mediated homologous recombination in primordial germ cells., 2016, 11(4): e154303.

[7] Oishi I, Yoshii K, Miyahara D, Kagami H, Tagami T. Targeted mutagenesis in chicken using CRISPR/Cas9 system., 2016, 6: 23980.

[8] Chen MJ, Chen DY, Xie L, Lu ZP, Yang MM, Mo LF, LU KH, Lu YQ.Effect of recipient embryos age on homing of chicken primordial germ cell after transplantation., 2016, 47(06): 1014–1018.陳美娟，陳東陽，謝龍，陸振萍，楊蒙蒙，莫麗芬，盧克煥，陸陽清. 受體胚齡對雞原始生殖細胞移植后歸巢的影響. 南方農業學報, 2016, 47(06): 1014–1018.

[9] Lillico SG, McGrew MJ, Sherman A, Sang HM. Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs., 2005, 10(3): 191–196.

[10] Intarapat S, Stern CD. Chick stem cells: Current progress and future prospects., 2013, 11(3): 1378– 1392.

[11] Lee HJ, Lee HC, Han JY. Germline modification and engineering in avian species., 2015, 38(9): 743–749.

[12] Macdonald J, Taylor L, Sherman A, Kawakami K, Takahashi Y, Sang HM, McGrew MJ. Efficient genetic modification and germ-line transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons., 2012, 109(23): E1466–E1472.

[13] He CW, He YL, Wu YH, Shao FH. Effects of different transfection reagents on lentiviral packaging efficiency and the lentiviral infection efficiency of guinea-pig fibroblasts after packaging.2015, (10): 34–38.何承文，何玉龍，吳月紅，邵風慧. 不同轉染試劑對慢病毒包裝及包裝后病毒感染豚鼠成纖維細胞效率的影響. 黑龍江畜牧獸醫，2015, (10): 34–38.

[14] Zhong CL, Li GL, Mo JX, Quan R, Wang HQ, Li ZC, Wu ZF, Zhang XW. Effects of parameters, plasmid dosages and topological structures on transfection efficiency of porcine fetal fibroblasts using different electroporators.2017, 39(10): 930–938.鐘翠麗, 李國玲, 莫健新, 全絨, 王豪強, 李紫聰, 吳珍芳, 張獻偉. 不同電轉儀的電轉參數、質粒用量和拓撲結構對豬胎兒成纖維細胞轉染效率的影響. 遺傳, 2017, 39(10): 930–938.

[15] Macdonald J, Glover JD, Taylor L, Sang HM, McGrew MJ. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells., 2010, 5(11): e15518.

[16] Choi JW, Kim S, Kim TM, Kim YM, Seo HW, Park TS, Jeong JW, Song G, Han JY. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells., 2010, 5(9): e12968.

[17] Park TS, Han JY. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens., 2012, 109(24): 9337–9341.

[18] Yamamoto Y, Usui F, Nakamura Y, Ito Y, Tagami T, Nirasawa K, Matsubara Y, Ono T, Kagami H. A novel method to isolate primordial germ cells and its use for the generation of germline chimeras in chicken., 2007, 77(1): 115–119.

[19] Wang L, Chen MJ, Chen DY, Peng SF, Zhou XL, Liao YY, Yang XG, Xu HY, Lu SS, Zhang M, Lu KH, Lu YQ. Derivation and characterization of primordial germ cells from Guangxi yellow-feather chickens., 2017, 96(5): 1419–1425.

[20] Taylor L, Carlson DF, Nandi S, Sherman A, Fahrenkrug SC, McGrew MJ. Efficient TALEN-mediated gene targeting of chicken primordial germ cells., 2017, 144(5): 928–934.

[21] Naito M, Harumi T, Kuwana T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens., 2015, 153: 50–61.

Optimization of transfection conditions of chicken primordial germ cells

Xian Zou, Yanhua He, Jingyi He, Yan Wang, Dingming Shu, Chenglong Luo

To improve the transfection efficiency of chicken primordial germ cells (PGCs), the present study evaluated the plasmid dosage and cell number on the efficiencies of three transfection reagents (Lipofectamine 2000, 3000 and LTX & Plus Reagent). PGCs was isolated from embryonic gonads of Huiyang bearded chicken. After 60 days of culture, the cells were transfected by using Lipofectamine transfection reagents withBac vectors coding for the green fluorescence protein (GFP). PGCs were passaged in culture and fluorescent cells were screened and selected by flow cytometry at three days after transfection. At three weeks post transfection, about 2000 cells were injected into the stage 16 Hamburger and Hamilton (HH) embryos and incubated until stage 30 HH. The results showed that Lipofectamine 3000 was the best for transfection of PGCs. The highest transfection efficiency of PGCs could be achieved with a combination of 3 μg plasmid, 4 μL Lipofectamine 3000 transfection reagent and 0.5×104PGCs cells. Flow cytometry analysis showed a 23.4% efficiency of stable transfection of PGCs using Lipofectamine 3000 withBac vector, which was improved 2 times or more over current commonly used methods. After reinjecting PGCs into recipient chicken embryos, GFP-positive cells were observed in the gonads of the recipient chicken embryo by fluorescence microscopy. The study comprehensively evaluated the factors of transfection reagents, plasmid dosage and cell number to optimize the transfection of PGCs, thereby providing a foundation for the efficient preparation of transgenic and gene-edited chickens.

chicken; primordial germ cells; stable transfection; Lipofectamine

2020-07-07;

2020-12-21

廣東省自然科學基金項目(編號：2018B030311044)，廣東省科技計劃項目(編號：2017B020232003，2019A050505007)，2020年省級現代農業科技聯盟建設共性關鍵技術創新團隊項目(編號：2020KJ106)，國家肉雞產業技術體系崗位科學家項目(編號：CARS-41)和科技創新戰略專項資金—高水平農科院建設項目(編號：R2017PY-QY007)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2018B030311044), the Science and Technology Program of Guangdong Province (Nos. 2017B020232003, 2019A050505007), 2020 Provincial Modern Agricultural Science and Technology Alliance Construction of Common Key Technology Innovation Team Project (No. 2020KJ106), the Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (No. CARS41), and Special Fund for Scientific Innovation Strategy-construction of High Level Academy of Agriculture Science (No. R2017PY-QY007)]

鄒嫻，博士，副研究員，研究方向：動物種質資源保護、育種與繁殖。E-mail: zouxian08@163.com

舒鼎銘，博士，研究員，研究方向：動物種質資源保護與創新利用。E-mail: shudingming@gdaas.cn羅成龍，博士，研究員，研究方向：家禽種質資源保護、遺傳育種與健康生產。E-mail: chenglongluo1981@163.com

10.16288/j.yczz.20-212

2021/2/1 15:08:18

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210201.1110.005.html

(責任編委: 姜雨)