類伸展蛋白OsPEX1對水稻花粉育性的影響

代航，李延，劉樹春，林磊，吳娟燕，張志杰，彭崎春，李楠，張向前

研究報告

類伸展蛋白OsPEX1對水稻花粉育性的影響

代航，李延，劉樹春，林磊，吳娟燕，張志杰，彭崎春，李楠，張向前

華南農業大學林學與風景園林學院，廣州 510642

類伸展蛋白(Leucine-Rich Repeats Extensins, LRX)是一類細胞壁嵌合蛋白，其N端包含一個LRR (leucine-rich repeats)結構域，C端含Extensins結構域。研究表明，LRX基因家族在擬南芥()花粉萌發和花粉管生長過程中具有重要作用，而水稻(L.) LRX基因家族是否在調控花粉發育方面具有保守的生物學功能尚不清楚。本研究首先進行了生物信息學分析，結果顯示，水稻LRX基因家族包括8個成員，、、位于水稻第1號染色體；和分別位于第2、第5、第6、第11和第12號染色體，其中OsPE基因在花粉中高表達，暗示可能參與了花粉發育調控。為此，本研究采用RNAi技術進一步研究了基因對花粉發育的影響。結果表明，基因的RNAi轉基因植株花粉敗育，結實率僅為10%-30%。qRT-PCR分析顯示，這些RNAi轉基因植株基因表達量顯著低于野生型，而且其表達量越低花粉育性亦隨之降低。上述研究結果表明，水稻基因是水稻花粉發育的重要基因，該基因的克隆和功能分析有助于進一步闡明水稻花粉發育調控的分子遺傳學機制。

水稻；類伸展蛋白；花粉育性

類伸展蛋白基因家族因其編碼的蛋白含有1個富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats, LRR)和1個伸展蛋白結構域，該家族又稱為LRX家族(leucine-rich repeats extensins)[1,2]。LRX蛋白在植物生長發育中具有重要作用，根據系統發生關系和表達模式可以將基因分為2類：主要在營養組織中表達的基因，通常用表示；主要在繁殖器官中高表達的基因，通常用()表示[3]。

LRX蛋白的功能眾多，除了促進細胞生長外，還影響營養生長、形態發生、授粉受精[4,5]等，隨細胞基質不同具有不同的功能，并表現出高度的組織、器官和細胞特異性[6]。通過對擬南芥()的研究，發現直接參與了細胞壁的形成[2]；在玉米(L.)花粉中Zmpexl蛋白也可能作為與雌蕊結合子相互作用的識別因子[1]。近來研究表明，擬南芥類伸展蛋白LRX3/4/5能夠與植物多肽類激素(rapid alkalinization factor, RALF) RALF22/23互作，而RALF與質膜定位的受體FER互作調控鹽脅迫[7]。此外，花粉表達的ANX1/2和BUPS1/2與AtRALF4/19互作，而AtRALF4/19能與AtLRX8/9互作調控擬南芥花粉管伸長[8,9]。擬南芥LRX4的LRR功能域能夠與CrRLK1L (receptor-like kinase)家族成員FERONIA (FER)直接互作，表明類伸展蛋白與CrRLK1L家族成員可能存在直接聯系[10]。考慮到CrRLK1L受體類激酶亞家族成員例如FER、ANXURs (ANX1/ANX2) 和BUDDHA'S PAPER SEAL1, 2 (BUPS1/BUPS2)可能是潛在的細胞壁感應器[11]，這些CrRLK1L蛋白跨細胞質膜定位能夠連接質外體和細胞質，在各種細胞過程有多重功能[12]。上述研究表明，類伸展蛋白可能參與了細胞壁與細胞表面信號的傳導過程[13]。

水稻(L.)是世界上最重要的糧食作物之一，是單子葉植物基因組研究的模式植物。目前，類伸展蛋白在水稻發育調控功能方面的研究還比較薄弱，尚無LRX類伸展蛋白調控水稻育性方面的相關報道。本研究在生物信息學分析的基礎上通過RNAi方法對水稻基因(LOC_Os11g43640)進行了育性相關研究，發現水稻類伸展蛋白基因在水稻花粉發育方面具有重要的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究轉化所用的水稻材料是粳稻品種中花11，其種子來自于廣東省植物分子育種重點實驗室。

1.2 生物信息學分析

以擬南芥中已知的LRX基因(,)序列檢索水稻基因組注釋數據庫MSU rice genome annotation release 7(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，搜索水稻的同源基因，并分析水稻中LRX類基因在染色體上的位置。根據數據庫中的注釋信息，繪制水稻LRX基因家族各基因結構圖，利用TBtools[14]繪制LRX基因的表達分析譜。

1.3 RNAi載體的構建

按照TransZolTMUp試劑盒說明書提取水稻組織總RNA，并將檢測合格的RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。以反轉錄的水稻葉片單鏈cDNA為模板，設計并合成特異性引物(p1390-KD-PEX-F：5′-AC-GCGTGGATCCAGGAGTCACCTGAGGAACCA-3′；p1390-KD-PEX1-R：5′-CTGCAGAAGCTTATTCTT-CTGGAGTCGGTGGA-3′)，擴增目的片段，回收之后將目的基因片段反向連接到植物表達載體pCAMBIA1390-Ubi，構建RNAi表達載體p1390-KD- PEX1。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂板過夜培養后挑選單菌落進行測序，挑選測序正確的質粒轉化到農桿菌EHA105，用于遺傳轉化。

1.4 農桿菌介導的遺傳轉化

參照王玉珍等[15]介紹的方法，用含有目的質粒的農桿菌菌液侵染中花11種子誘導的愈傷組織，之后對侵染的愈傷組織進行抗性篩選以及抗性愈傷組織的分化生根，最后對幼苗進行煉苗和移栽。

1.5 轉基因植株檢測

對遺傳轉化得到的轉基因植株，按照張向前等[16]介紹的方法進行DNA的快速提取，通過潮霉素抗性基因PCR擴增檢測是否為轉基因陽性植株。

1.6 轉基因植株基因表達分析

水稻花粉總RNA的提取利用TransZolTMUp試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行，采用Primer 5.0設計qRT-PCR引物(RT-OsPEX1-F：5′- GAGATGGGCTACCTGCAGAACA-3′；RT-OsPEX1- R：5′-GTAGGCGAAGCTGAAGTTGACG-3′)，以(Actin-F：5′-GATCACTGCCTTGGCTCCTA-3′；Actin- R：5′-GTACTCAGCCTTGGCAATCC-3′)作為內參，分析野生型和RNAi轉基因植株基因在花粉中的相對表達量。采用TaKaRa SYBR Primer Ex(Perfect Real Time)試劑盒進行Real-time PCR擴增。在冰上配制Real-time PCR反應體系，重復3次。反應體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq10μL，引物F (10 μmol/L) 0.8 μL，引物R (10 μmol/L) 0.8 μL；cDNA模板10 ng，ddH2O補足20 μL。

1.7 轉基因植株表型觀測

收集T0代轉基因植株的種子，連續自交種植兩季之后觀測T2代表型。RNAi轉基因植株結實率統計：轉基因水稻T2代成熟后，統計每株各個稻穗的谷粒總數及實粒數。每穗結實率=實粒數/谷粒總數。單株結實率為每穗結實率的平均值。

花粉染色：RNAi轉基因植株和野生型抽穗后，取主穗中上部花藥長度超過谷殼長度2/3的成熟頂端穎花4-5朵，置于FAA (70%乙醇∶冰乙酸∶甲醛= 89∶6∶5)固定液中固定保存。碘-碘化鉀(I2-KI)溶液染色后在普通光學顯微鏡下進行觀察。根據花粉粒的形狀、大小和著色情況將花粉分為可育花粉和敗育花粉兩種類型，可育花粉呈圓球形，積累淀粉較多，通常被I2-KI染成深藍色。而敗育花粉常表現出畸形，往往不含淀粉或積累淀粉較少，被I2-KI染成黃褐色。每朵穎花取3個視野，每株觀察3朵穎花，共9個視野，觀察花粉染色情況。

2 結果與分析

2.1 水稻LRX基因家族在染色體上的分布

本研究以擬南芥中已知的基因(、At1g12040)蛋白序列為模板搜索水稻的同源基因。在水稻基因組注釋數據庫MSU rice genome annotation release 7(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，共找到8個LRX類基因，分布于第1、2、5、6、11、12號染色體上，其中第1號染色體上最多，有3個成員，分別是、和；其他5條染色體上各有1個成員，分別是位于2號染色體上的，位于5號染色體上的，位于6號染色體上的，位于11號染色體上的和位于12號染色體上的(圖1)。

2.2 水稻LRX基因家族生物信息學分析

根據上述水稻基因組注釋數據庫上的注釋信息，得到水稻8個LRX類基因的′到′的序列信息。這8個基因的基因結構如圖2所示。其中和的編碼區只包含一個外顯子，不存在內含子序列；而基因的編碼序列包含兩個外顯子和一個內含子。編碼蛋白質長度在455 aa~1399 aa之間，其中編碼的蛋白最長(1399 aa)。

根據其表達模式(圖3)，水稻中的8個基因可以分為兩組：、、和主要在生殖器官中表達(尤其在花藥中)，在營養器官中表達量較低或者不表達；、、和在生長的各個時期均有表達，其中在營養器官及生殖器官中均有表達但是表達量較低。這也暗示著兩組基因可能在不同的生長時期，參與水稻生長發育的調節。

圖1 水稻類伸展蛋白基因在染色體位置示意圖

圖2 水稻類伸展蛋白基因結構

黑色區域：外顯子；黑色線：內含子；灰色區域：非編碼區。

2.3 水稻OsPEX1基因RNAi轉基因植株的獲得

表達譜分析表明，水稻中PEX類基因在花藥中高表達，這說明此類基因可能與花藥的形成與發育相關。為了探究PEX類基因與花藥發育的關系，本研究利用RNAi方法對基因進行了功能研究。

本研究通過構建基因的RNAi表達載體，利用農桿菌介導轉化的方法轉化粳稻品種中花11，獲得RNAi轉基因植株。轉基因T0代共獲得40株，用潮霉素基因特異引物進行PCR擴增，檢測T0代植株(圖4)，共獲得25株轉基因陽性株。

圖3 水稻類伸展蛋白基因表達模式

2.4 水稻OsPEX1基因RNAi轉基因植株表型特征

對水稻基因RNAi轉基因植株表型進行分析，結果顯示，與野生型中花11相比，所有轉基因植株的結實率顯著降低，結實率在10%~30%之間，個別植株甚至完全不育(圖5，A和B)。基因表達分析結果顯示，轉基因植株的育性與基因的表達量呈現出正相關性，即的表達量越低，其對應植株的結實率越低(圖5，B和C)。

為了進一步闡釋影響水稻結實率的原因，本研究對轉基因T2代植株的花粉育性進行統計觀察。與野生型可育花粉相比，轉基因陽性植株的花粉育性顯著降低(圖6)。轉基因陽性植株的花粉形態不規則，不能被I2-KI著色，呈現出雄性不育特征(圖6)。綜上所述，可能在水稻花藥、花粉發育中起到了至關重要的作用，降低的表達，會影響花粉的正常發育，進而導致結實率降低。

圖4 轉基因植株PCR檢測

M：DL2000 Marker；WT：野生型植株；KD：RNAi轉基因植株。

圖5 水稻野生型和OsPEX1基因RNAi轉基因植株表型及其表達分析

A：野生型和轉基因RNAi植株的主穗；B：野生型和轉基因RNAi植株的單穗結實率；C：野生型和轉基因RNAi植株中基因的相對表達量。WT：野生型植株；KD：RNAi轉基因植株。

圖6 水稻野生型和OsPEX1基因RNAi轉基因T2代植株花粉I2-KI染色

WT：野生型植株；KD：RNAi轉基因植株。

3 討論

在開花植物中，花粉發育是一個非常復雜的生物學過程[17]。小孢子母細胞在花粉囊中減數分裂產生小孢子，進一步發育成花粉粒，花粉粒成熟后從花藥中釋放出來[18]。高等植物小孢子所處的花粉囊被來源于體細胞絨氈層中的糖類和脂類所填充，進而提供了花藥早期發育所需的營養物質[19]。目前，關于花粉育性基因相關調控機制的研究主要涉及花粉敗育和花粉缺失相關基因[20~24]。其中，花粉敗育是指，花粉受內外環境因素影響而不能正常發育，主要原因是花粉母細胞不能正常減數分裂和絨氈層細胞異常[25]。在雄性不育系小麥S-1376中，不育系花藥絨氈層細胞提前至四分體時期降解，并在各發育時期伴隨著多糖、脂類和蛋白質等物質異常分布和積累，致使小孢子在由單核晚期向二核期發育的過程中物質供應不足，使得小孢子細胞核分裂異常，最終表現為花粉敗育[26]。在()突變體中，在花藥的外層不存在表皮蠟狀晶體，并且由于突變體花粉中花粉外壁形成的缺陷，小孢子的發育被嚴重阻礙并最終被破壞從而導致花粉敗育[27]。對于水稻花粉半不育性突變體()，由于編碼的蛋白缺失，使得花粉減數分裂減弱，花粉生活力降低，表現出半不育性[22]。突變體()的絨氈層不能分化和液泡化，并且小孢子母細胞不能分裂成小孢子，中間層細胞不退化，因而花粉囊不能產生正常花粉[28]。最新研究表明，擬南芥()突變體通過促進細胞周期關鍵蛋白KRP1的降解，在花粉發育中發揮重要作用[29]。通過對一個水稻雄性不育突變體()的研究發現，該突變體在減數分裂過程中出現胼胝質沉積缺陷，而胼胝質的異常沉積會導致小孢子敗育[30]。這些基因的發現以及功能研究，使人們對花粉育性相關的調控機制有了更深的認識。

花粉成熟后，花藥破裂，花粉釋放，經過風力或昆蟲的作用落到同一朵花或另一朵花雌蕊柱頭上，引發一系列復雜的細胞形態變化和生理生化變化，其中花粉萌發、花粉管生長對于雙受精的完成至關重要[31]。對擬南芥AtLRX8-11的研究表明，LRX蛋白參與了花粉管的生長以及花粉管細胞壁完整性的維持。通過分析、、和這4個基因的三突變體和四突變體在花粉以及花粉管中的表達，發現這些LRX蛋白與花粉的萌發以及花粉管的生長密切相關。突變體的花粉管細胞壁組裝受到嚴重影響，胼胝質和果膠過度積累，導致花粉管異常膨大和破裂等[32~34]。花粉管細胞壁成分的變化可能與囊泡運輸有關，而花粉管的破裂可能與Ca2+的含量有關[33]。

LRX蛋白同源比對表明，水稻類伸展蛋白有8個，第1染色體有3個，第2、5、6、11、12染色體各有1個。目前，水稻類伸展蛋白調控植物生長發育的機理研究還比較薄弱，尚無水稻LRX類伸展蛋白調控花粉發育的相關報導。植物除了具有復雜完善的膜信號系統，還擁有細胞壁信號傳導途徑，使其能夠感知、傳導細胞壁狀態以及細胞壁組份變化，以便更好的協調植物生長發育和提高植物適應環境變化的能力[35]。近來研究表明，擬南芥花粉表達的LRX蛋白AtLRX8/9能夠與植物快速堿化因子AtRALF4/19互作，而AtRALF4/19進一步通過與CrRLK1L受體類激酶互作共同調控擬南芥花粉管萌發和伸長[9,32~34]。這些研究表明，細胞壁LRX蛋白可能通過LRX-RALF-CrRLK1L途徑參與了植物細胞信號轉導過程。水稻基因組有16個CrRLK1L受體類激酶家族成員，而RALF家族成員超過40個(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。鑒于植物LRX、CrRLK1L以及RALF蛋白家族的保守性，水稻類伸展蛋白OsPEX1應該也有類似的分子調控模式，但有待于進一步證明。

本研究的RNAi轉基因植株花粉敗育，結實率顯著降低，有別于目前已報道的花粉不育變異材料。水稻(LOC_Os11g43640)是1個類伸展蛋白編碼基因，不同于已克隆的花粉發育相關基因。綜上分析可知，本研究所關注的水稻基因是調控水稻花粉發育的新基因，該基因的克隆和功能分析有助于進一步理解水稻花粉發育調控的分子遺傳學機制。

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Effect of extensin-like OsPEX1 on pollen fertility in rice

Hang Dai, Yan Li, Shunchun Liu, Lei Lin, Juanyan Wu, Zhijie Zhang, Qichun Peng, Nan Li, Xiangqian Zhang

LRXs (leucine-rich repeat extensins) are chimeric cell wall proteins containing an N-terminal leucine-rich repeat (LRR) and a C-terminal extensin domain. Increasing evidences suggest that LRXs family genes play important roles in pollen germination and pollen tube growth in. However, the functions of rice (L.) LRX genes in pollen development remain poorly understood. Bioinformatics analysis showed that the rice LRX gene family consist of eight members, namely,andlocated on chromosome 1,, O,andlocated on chromosome 2, 5, 6, 11 and 12, respectively. Thegene is preferentially expressed in rice anther, suggesting that itmay be involved in the regulation of pollen development. Next, we further investigated the role of thegene in rice by knockdown of its expression using an RNAi approach. TheRNAi transgenic lines showed a significant decrease in seed setting rate (10%~30%) due to pollen sterility. Further quantitative RT-PCR analysis indicated that thegene was significantly down-regulated in the RNAi transgenic lines. The results indicate that theplays an important role in the regulation of rice pollen development. Further studies on this gene could provide insights on the molecular and genetic mechanisms in this developmental process.

rice; leucine-rich repeats extensins; pollen fertility

2020-09-17;

2020-12-15

國家自然科學基金面上項目(編號：31671594)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31671594)]

代航，在讀碩士研究生，專業方向：農藝與種業。E-mail: 398035743@qq.com

張向前，博士，教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.20-296

2021/3/2 17:09:27

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210302.1123.001.html

(責任編委: 儲成才)