HBsAg陰性伴HBcAb陽性患者血清HBV-DNA含量檢測對隱匿性乙型肝炎病毒感染的檢出價值

劉曉紅，單 穎，孫朝慶，紀玉紅，郭 靜

(1.錦州醫科大學基礎醫學院，遼寧 錦州 121001；2.朝陽市第二醫院檢驗科，遼寧 朝陽 122000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)包含正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬，其中正嗜肝DNA病毒屬可引起人體HBV感染。乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是目前臨床判斷HBV感染的主要乙型肝炎病毒血清標志物。血清HBsAg陽性可確診HBV感染，若持續6個月以上陽性可確診慢性HBV感染。乙型肝炎核心抗體(Hepatitis B core antibody，HBcAb)是人體HBV感染后最早出現的一種病毒抗體，單項HBcAb陽性提示既往HBV感染，HBsAg轉陰和HBcAb出現提示HBV清除和乙型肝炎痊愈，且病毒清除后HBcAb仍會長期存在。隨著熒光定量PCR的逐漸開展，發現HBsAg檢測陰性但肝臟或血清HBV DNA含量陽性的現象并不少見，在排除HBV窗口期感染后可明確隱匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection，OBI)。既往研究[1-2]指出，依據血清是否存在HBcAb和乙型肝炎表面抗體(Hepatitis B surface antibody，HBsAb)，OBI患者的血清學可分為血清學陽性(HBcAb陽性，HBsAb陽/陰性)和血清學陰性(HBcAb、HBsAb均為陰性)，其中前者約占78%，后者約占22%，由此可見HBcAb陽性與OBI可能存在緊密關聯。鑒于此，本研究對HBsAg陰性伴HBcAb陽性血清采用PCR儀進一步行HBV DNA含量檢測，并對OBI檢出結果進行探討分析，為臨床診斷OBI和降低OBI所致乙型肝炎病毒傳播風險提供參考，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集朝陽市第二醫院檢驗科2019年9月至2020年8月期間1138例經化學發光免疫分析法(CLIA)檢測乙型肝炎病毒標志物(HBV-M)且篩查結果提示HBsAg陰性伴HBcAb陽性的患者。其中，男性729例(64.06%)，女性409例(35.94%)；年齡18～73歲，其中18～29歲132例(11.60%)，30～59歲704例(61.86%)，60歲及以上302例(26.54%)，平均年齡(47.62±10.25)歲。所有患者既往均無肝腫瘤放化療或手術史，排除HBV窗口期感染，均積極配合相關檢測。本研究獲得醫院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 血清樣本采集：采集靜脈血4 ml，3000 r/min離心10 min，收集血清置于冰箱-60 ℃保存，48 h內完成檢測。

1.2.2 HBV-M檢測：采用雅培ARCHITECT i2000SR化學發光免疫分析儀及配套試劑盒對HBsAg、乙肝病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen，HBeAg)、HBsAb、乙肝病毒e抗體(Hepatitis B virus e antibody，HBeAb)、HBcAb進行檢測。HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb試劑盒批號分別為07395FN00、10267BE00、06440FN00、09197BE00、09542BE00，均購自雅培公司。根據CLIA定量分析結果判定HBV-M檢測項目陽/陰性。

1.2.3 HBV-DNA含量檢測：采用美國ABI 7500熒光定量PCR儀對HBV-DNA含量進行檢測，試劑盒(批號：MF20160102)購于上海浩源科技有限公司。HBV-DNA含量值最低檢出限為10 IU/ml。

1.2.4 肝功能檢查：明確HBV-M檢測結果后均建議進一步做肝功能檢查，其中596例在我院接受肝功能檢查。采用羅氏Cobas 8000生化分析儀及配套試劑檢測血清天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和總膽紅素(TBIL)水平。三者正常值范圍依次為5～40 U/L、7～40 U/L和3～22 μmol/L，且AST/ALT值越高表示肝功能損傷越嚴重。由資深肝病醫師綜合判定肝損傷情況，必要時進行肝穿刺活檢。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件對所得數據進行分析。根據研究需要對受檢樣本進行分組，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 1138例患者不同HBV-M模式間HBV-DNA陽性情況比較 見表1。經PCR檢測，1138例患者中35例為OBI，檢出率3.08%。根據CLIA檢測結果將1138例患者HBV-M檢出模式分成模式A組(HBcAb陽性)、模式B組(HBcAb、HBeAb陽性)、模式C組(HBcAb、HBsAb陽性)和模式D組(HBcAb、HBeAb、HBsAb陽性)。HBV-DNA陽性檢出率由高到低依次為模式C組、模式A組、模式B組和模式D組，其中模式A、B、C組HBV-DNA陽性率比較均無統計學差異(均P>0.05)；模式C組HBV-DNA陽性率明顯高于模式D組(P<0.05)；模式A、B組與D組比較均無統計學差異(均P>0.05)。

表1 1138例患者不同HBV-M模式間HBV-DNA陽性情況比較

2.2 1138例患者不同HBcAb反應性間HBV-DNA陽性情況及分布比較 見表2。根據血清樣本HBcAb吸光度/臨界值(S/Co值)將1138例患者分為反應性A組(1.0≤S/Co值<5.0)、反應性B組(5.0≤S/Co值<10.0)和反應性C組(S/Co值≥10.0)，并將S/Co值≥10.0定義為高反應性。結果發現，反應性A、B、C組的HBV-DNA陽性率依次升高，且反應性C組HBV-DNA陽性率明顯高于反應性A、B組，反應性B組HBV-DNA陽性率又明顯高于反應性A組(均P<0.05)。HBV-DNA載量分布：<20 IU/ml者25例，占71.43%(25/35)；20～100 IU/ml者7例，占20.00%(7/35)；≥100 IU/ml者3例，占8.57%(3/35)。結果發現，反應性A、B、C組HBV-DNA分布比較均無統計學差異(均P>0.05)。

表2 1138例患者不同HBcAb反應性間HBV-DNA陽性情況及分布比較[例(%)]

2.3 596例患者不同肝功能間HBV-DNA陽性情況及HBcAb反應性比較 見表3。根據有無肝損傷將接受肝功能檢查的596例患者分為正常組(459例)和肝損傷組(137例)。結果發現，肝損傷組HBV-DNA陽性率、HBcAb高反應性均明顯高于正常組(均P<0.05)。

表3 596例患者不同肝功能間HBV-DNA陽性情況、HBcAb反應性比較[例(%)]

3 討 論

近年來HBV相關研究和感染傳播的防控工作取得長足進步，但HBV感染在世界范圍內仍屬于嚴重的公共衛生難題。HBV感染相關流行病學報道[3-4]指出，我國人群HBV感染呈高發流行特征，地區分布差異顯著，HBV攜帶者高達10%，每年新增約50萬人，且每年因HBV感染所致肝硬化、肝癌而死亡的人數高達26萬。由此可見，HBV感染可造成沉重的社會負擔，已成為居民死亡的常見病因，對HBV感染防控和相關診治工作提出了更高的要求[5]。

自1978年醫學界首次提出OBI以來，隨著分子生物學技術和PCR檢測技術的應用，相關研究已取得較大進步，認知水平明顯提高。目前將OBI定義為：排除HBV感染急性窗口期以后，經嚴格檢測明確HBsAg陰性，血清和(或)肝組織中HBV-DNA陽性，且HBV-DNA載量<200 IU/ml。既往報道[6]指出，HBsAg陰性獻血者、隱匿性慢性肝炎、慢性丙型肝炎和原發性肝癌等均有OBI檢出。但OBI發病機制復雜，至今尚未完全明確，給臨床診治及預防帶來諸多困難，多猜測與HBV基因突變、HBV表觀遺傳變異、合并丙型肝炎病毒(HCV)以及宿主免疫應答反應等有關[7]。李奇等[8]對10359份血清樣本進行檢測，OBI檢出率為0.191%，檢出9種HBV-S基因主要親水區(MHR)突變類型，且部分突變類型具有促進腫瘤生長的生物學特征，提示OBI可能增加肝細胞癌的進展風險。報道[9]發現，單純HCV感染患者和HCV/OBI共感染患者的分子流行病學特征并無明顯差異，也可能是導致部分OBI漏檢的原因。HBcAb是臨床評估HBV感染的標志性抗體，HBcAb陽性表示既往HBV感染，單項HBcAb陽性多見于急性HBV感染窗口期、HBcAb陽性孕婦所生新生嬰兒和接受輸血者等群體。由于OBI的流行病學特征極其復雜，不同地區、族群、性別、年齡的人群OBI發病情況統計存在諸多困難，加上目前檢測技術存在差異，因此關于OBI的潛在影響尚存在一定爭議，如OBI潛在傳染性評估、是否增加肝細胞癌的罹患風險等還未形成統一觀點。筆者在臨床工作中發現，HBsAg陰性伴HBcAb陽性者并不少見，作為OBI患者的常見血清學特征，血清HBcAb水平可明顯升高。

本研究收集的1138例HBsAg陰性伴HBcAb陽性患者的血清樣本均經CLIA篩查明確。與常規酶聯免疫吸附法(ELISA)比較，CLIA所需配套儀器和試劑成本提高，但檢測時間明顯縮短，而且靈敏度和特異度更高，因此應用廣泛。此外，雖然時間分辨熒光分析技術(TRFIA)也具備較好的檢測效果，但檢測時間長，且標本消耗量大，檢測技術要求較高，并未廣泛應用。進一步行PCR檢測顯示，共檢出35例OBI患者(HBV-DNA陽性)，檢出率為3.08%，此結果明顯高于報道[10]中的0.90%，原因可能在于血清樣本存在差異。35例OBI患者HBV-DNA載量均≤200 IU/ml，其中<20 IU/ml、20～100 IU/ml、≥100 IU/ml分別占71.43%、20.00%和8.57%，符合OBI的HBV低水平復制特征。不同HBV-M模式中，模式C組(HBcAb、HBsAb陽性)OBI檢出率最高(4.11%)，其次為模式A組(HBcAb陽性)，模式D組(HBcAb、HBeAb、HBsAb陽性)檢出率最低(1.61%)，分析原因與HBeAb陽性時體內HBV復制相對靜止有關[11]。

本研究根據HBcAb反應性(S/Co值)進行分組，發現隨著S/Co值升高，HBV-DNA陽性檢出率也明顯升高，HBsAg陰性伴高反應性HBcAb(S/Co值≥10.0)患者的OBI發病率高達14.29%，與既往報道[12]相符，提示CLIA篩查明確HBsAg陰性伴HBcAb陽性者若血清HBcAb水平異常偏高，OBI風險可能增加。有研究[13-14]發現，單獨HBcAb陽性作為OBI的常見血清學形式，血清HBcAb水平與肝組織中共價閉合環狀DNA(cccDNA)水平緊密相關，也在一定程度上支持本研究觀點，但OBI患者cccDNA水平的影響因素復雜，血清HBcAb水平的影響作用途徑尚未完全明確[15]。本研究顯示反應性A組、B組和C組HBV-DNA分布比較無統計學差異，提示HBcAb反應性對OBI患者HBV-DNA分布無明顯影響，但需后續研究擴大樣本深入探討。

本研究中596例患者接受常規肝功能檢查，肝損傷者137例(22.99%)，結果顯示肝損傷組HBV-DNA陽性率、HBcAb高反應性均明顯高于正常組，結合上述討論，提示HBsAg陰性伴HBcAb陽性患者可存在肝損傷，肝損傷亦提示較高OBI可能。因此，對存在OBI風險人群，建議定期進行肝功能檢查。OBI患者必要時行肝穿刺活檢，對評估肝損傷意義更大，若提示纖維化或炎癥，則需積極接受抗病毒治療[16]。但肝損傷原因除HBV感染因素外，還與患者飲酒、自身免疫性疾病、遺傳代謝性、肥胖等因素有關，對結果可能造成一定偏倚，這也是本研究存在的不足之處。

綜上所述，常規檢測HBsAg陰性伴HBcAb陽性提示存在OBI可能，且OBI發生風險隨HBcAb反應性S/Co值升高而升高，應進一步行HBV-DNA含量檢測判斷OBI，降低OBI漏診和臨床HBV傳播風險。