膽管細胞型肝癌lncRNA-mRNA 共表達網絡的高通量基因芯片篩查分析

唐津天 王瑞賓 王伯慶▲

1.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學第三臨床醫學院，新疆烏魯木齊 830000

膽管細胞型肝癌是來源于肝內膽道上皮細胞的惡性腫瘤，發病率較低，沒有特異性的腫瘤標志物用于血清學診斷，糖類抗原（CA）19-9 和胚胎抗原（CEA）的增高可能有助于診斷[1]。病理表現為腺癌，肝外受侵表現為淋巴結轉移和周圍神經侵犯[2]。大多數膽管細胞型肝癌發病呈散發性，沒有特征性的風險因素[3]。目前，膽管細胞型肝癌的發病機制尚不明確。

人類基因組研究發現93%的DNA 被轉錄為RNA，其中2%可翻譯成蛋白轉錄產物，其余98%均為無編碼功能的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[4-5]。長鏈非編碼RNA 是非編碼RNA 的一種，在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多層面調控基因的表達。研究證實lncRNA 與人類多種重大疾病的發生發展密切相關[6-10]。本研究借助于高通量生物芯片進行篩選分析，構建共表達網絡，獲取與腫瘤相關lncRNAmRNA，為膽管細胞型肝癌的診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 標本收集

選取2017 年1 月—6 月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院（以下簡稱“我院”）肝膽外科手術切除的5 例膽管細胞型肝癌新鮮組織標本。標本自手術中離體后立即取樣，注明標識后置入液氮中保存。

5 例經病理證實均為膽管細胞型肝癌患者，女3 例，男2 例；年齡37～55 歲，中位年齡45.2 歲；腫瘤均單發，最大徑介于2.2～4.7 cm，平均（4.2±0.3）cm，病理分期均為T1N0M0（AJCC，第8 版）。本研究經醫院醫學倫理委員會的批準，并獲得患者及其家屬的同意。

1.2 RNA 的提取和數據處理

RNA 提取試劑盒提取樣本總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。總RNA 質檢合格后，樣本依次進行標記、芯片雜交、洗脫和染色，最后掃描獲得原始數據圖像。樣本數據分析由北京康普森生物技術有限公司支持完成。

1.3 差異mRNA 的篩選

使用Affymetrix 軟件對獲取的數據進行分析。根據篩選條件log2|FC|≥1 且P ≤0.05，對得到的標準化信號值的FC 值和差異顯著性P 值進行篩選。

1.4 lncRNA-mRNA 共表達網絡的構建

Affymetrix 軟件進行統計學分析后獲取差異lncRNA。對Top10 差異lncRNA 進行共表達分析，獲得相應的靶基因。依據Gene Ontology 數據庫和KEGG 數據庫進行分析，預測lncRNA 的功能。再次選取Top10 差異lncRNA 中|FC|值最高的Top1 lncRNA進行GO 富集和Pathway 分析。

1.5 qRT-PCR 驗證分析

另選取我院腫瘤標本庫保存的膽管細胞型肝癌的組織標本30 例。隨機抽取Top10 差異mRNA 中的1 個差異mRNA 進行qRT-PCR 驗證；對Top1 lncRNA及其共表達mRNA 進行qRT-PCR 驗證。根據Real-Time PCR 原始檢測數據，按照F=2-△△Ct計算RNA 的相對表達量。組織RNA 的提取使用天根生化的動物組織總RNA 提取試劑盒（生產批號：DP451）。使用Takara 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒（生產批號：RR047A）進行反轉錄獲取cDNA，利用Takara 的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（生產批號：RR420）進行Real-Time PCR反應。從NCBI 數據庫和PrimerBank 數據庫查找引物序列，委托生物公司設計合成。

1.6 統計學方法

使用SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析。正態分布計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；偏態分布計量資料采用中位數表示。多組間比較選擇單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異mRNA 和lncRNA 的篩選

在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1 的情況下，共篩選獲得差異mRNA 475 個，其中上調mRNA 213 個，下調mRNA 262 個；共篩選獲得差異lncRNA 共計438 個，其中上調lncRNA 131 個，下調lncRNA 307 個。根據差異表達的mRNA 和lncRNA 進行聚類分析，分析結果見圖1 和圖2（封四）。根據log2|FC|值，其中差異表達的Top10 mRNA 和lncRNA 見表1～2。

圖1 差異表達mRNA 和lncRNA 的火山圖分布

表1 排名前10 的差異表達的mRNA

表2 排名前10 的差異表達的lncRNA

2.2 mRNA-lncRNA 共表達分析

對Top10 差異lncRNA 進行lncRNA 與mRNA的共表達分析，獲得相應的靶基因。在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1，相關系數|cor|≥0.95 的情況下，Top10 差異lncRNA 共表達的mRNA 數目見表3。對Top10 lncRNA 相應靶基因的GO 富集分析和Pathway分析，因獲得的數據信息量巨大，僅選擇Top1 lncRNA進行GO 富集分析和Pathway 分析。

表3 排名前10 的lncRNA 共表達mRNA 數目

2.3 CPS1-IT1 的共表達分析

選擇|FC|最大值的lncRNA CPS1-IT1 進行共表達分析。通過GO 分析最終篩選獲得與之關系密切的共表達基因是CSNK1E，同時對CPS1-IT1 的功能進行分類（圖3）。通過Pathway 分析，獲得CPS1-IT1 相關的信號通路（圖4）。

2.4 LncRNA CPS1-IT1 的驗證

實時熒光定量PCR 檢測30 例膽管細胞型肝癌的癌組織和癌旁正常肝組織中靶基因mRNA 和lncRNA 的表達豐度。隨機抽取Top10 mRNA 中的TC1200010108.hg.1（GYS2）和CPS1-IT1 的共表達基因CSNK1E 進行驗證分析。結果顯示TC1200010108.hg.1（GYS2）在癌組織中呈相對表達下調，癌組織2-△△Ct=0.5413，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05；CSNK1E在癌組織中呈表達上調，癌組織2-△△Ct=1.8907，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05（圖5）。同時對Top1 lncRNA 進行驗證，結果顯示CPS1-IT1 在癌組織中呈相對表達下調，癌組織2△△Ct=0.2973，癌旁正常肝組織2-△△Ct=1，P ＜0.05（圖5）。

圖3 lncRNA CPS1-IT1 的功能分類

圖4 lncRNA CPS1-IT1 共表達基因Pathway 分類圖

圖5 CPS1-IT1、GYS、CSNK1E 在組織RNA 中的表達水平

3 討論

本研究通過生物芯片對膽管細胞型肝癌標本組織進行高通量分析，結果顯示在篩選閾值為P ≤0.05，log2|FC|≥1 的情況下，下調表達的差異mRNA 多于上調表達的差異mRNA。同樣的情況在lncRNA 中更為明顯，在共計438 個差異lncRNA 中，下調表達的差異lncRNA 為307 個，上調表達的差異lncRNA 僅為131 個，這種表達趨勢在Top10 差異mRNA 和lncRNA中更加明顯。對Top10 差異mRNA 進行分析發現，大多數mRNA 涉及糖代謝和脂代謝。例如，HSD17B13為蛋白編碼基因，與脂質代謝相關[11]。GYS2 為肝糖原合成酶，是糖代謝信號通路中的關鍵蛋白之一，在胰島素信號通路和糖原代謝信號通路中發揮重要作用。GYS2 表達下調導致下游肝糖原合成不足，加速細胞對葡萄糖的攝取，符合惡性腫瘤對葡萄糖高代謝的特征[12]。CFHR4 則與脂質的運輸密切相關。APOF 參與脂質轉運，與脂蛋白代謝密切相關[13]。THRSP 在脂質合成中發揮調節作用，特別是對中長鏈脂肪酸的三酰甘油合成具有重要意義[14]。由此可見，在肝膽管細胞型肝癌中，腫瘤組織的糖代謝和脂質代謝紊亂相對明顯。

因高通量分析后獲得的數據信息量巨大，因此本研究依據差異倍數，選擇Top1 lncRNA 進一步分析。CPS1-IT1 位于編碼氨甲酰磷酸合成酶1 基因的內含子，是近年來確定的新的腫瘤相關分子，主要功能角色尚不清楚，目前已經在部分腫瘤中進行了探索性研究。研究發現，CPS1-IT1 在肺癌中具有抑制腫瘤的作用，其過表達可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲[15]。此外，CPS1-IT1 在肝細胞癌組織中的表達顯著降低，通過調節HIF-1α 活性抑制上皮間質轉化抑制肝癌轉移[16]。進一步研究表明，Foxa2 表達增加促進CPS1-IT1上調，降低HIF-1α 的活性，抑制上皮-間質轉化[17]。在卵巢癌的研究中也證實CPS1-IT1 是一種保護性的預后因子[18]。

對CPS1-IT1 進行共表達分析，最終篩選獲得CPS1-IT1 的共表達基因為CSNK1E。通過CPS1-IT1的功能分析發現，CPS1-IT1 及其共表達mRNA 網絡可能參與有絲分裂細胞周期轉換、Wnt 信號通路的調控、晝夜節律基因表達的調節等。此外，通過Pathway分析發現，CPS1-IT1 和其共表達基因CSNK1E，通過FOXO 信號通路參與糖酵解、葡萄糖異生等；通過Wnt 信號通路參與細胞周期的調控；通過Hedgehog 信號通路參與細胞增殖；通過Hippo 信號通路參與蛋白質水解調控；通過晝夜節律通路參與生物鐘基因的調控。

酪蛋白激酶1E（casein kinase 1 epsilon，CSNK1E）可以作用于底物酪蛋白使其磷酸化，主要參與Wnt信號通路的轉導，也是生理性晝夜時鐘調控的核心成員之一[19-20]。生物鐘基因突變常與代謝缺陷有關，包括糖酵解途徑、脂肪酸合成、脂肪酸氧化和細胞解毒等，特別是在脂質和葡萄糖代謝方面[20-25]。這些數據表明，晝夜節律和代謝途徑的相互協調對于細胞內穩態和機體健康是至關重要的。

本研究顯示，膽管細胞型肝癌的糖代謝和脂質代謝紊亂相對明顯，其機制之一可能是通過lncRNA CPS1-IT1 和共表達基因CSNK1E 介導下調控腫瘤的葡萄糖和脂質代謝，具體的信號通路仍需進一步驗證。