祖卡木顆粒治療新型冠狀病毒肺炎的潛在物質基礎研究

范晨陽 馬 璇,2 季志紅 李柯翱 李治建

1.新疆奇沐醫藥研究院（有限公司）研發部，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011 3.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所毒理學研究室，新疆烏魯木齊 830049

自2019 年12 月新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）發生以來，全球感染人數不斷增加，國家衛生健康委員會發布的《關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，從第3 版到第7 版均推薦使用中醫藥[1-2]。不同地區根據各地特點制訂了適合的防治方案[3]。新疆也制訂了相應的中醫藥防治方案，其中《新疆維吾爾自治區新型冠狀病毒感染的肺炎維吾爾醫診療專家共識》指出如屬于濕熱的血液質腐濁型患者，推薦使用祖卡木顆粒[4-5]，已報道的文獻顯示祖卡木顆粒具有抗病毒與抗炎的作用[6]，對于感冒引起的咳嗽、發熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等癥具有顯著的療效[7]。

本研究運用網絡藥理學分析技術探究祖卡木顆粒中山柰、睡蓮花、薄荷等十味藥材的活性成分及其參與治療COVID-19 的物質基礎與作用機制，運用分子對接技術探索其分子生物學方面潛在的作用機制。

新型冠狀病毒3CL 水解酶（SARS-CoV-2 3CL 水解酶）是冠狀病毒的主要蛋白之一，在病毒的增殖過程中發揮重要作用，其基因具有高度的保守性，被作為藥物設計的關鍵靶點[8-10]。血管緊張素轉化酶Ⅱ（ACE2）受體結合域是COVID-19 S 蛋白與ACE2 受體結合的關鍵結構，其與ACE2 的親和力與病毒傳播速度有關。兩者結合可激活宿主免疫系統，從而啟動“炎癥風暴”，本研究從阻斷炎癥風暴，干預病情進展的角度[11]，選取SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白作為受體蛋白進行分子對接研究。

1 方法

1.1 祖卡木顆粒中活性成分篩選與靶點蛋白搜集

利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），在“Herb name”檢 索欄，分別以“山柰”“薄荷”“大棗”“甘草”“大黃”“罌粟殼”為關鍵詞檢索，獲取各味藥材化學成分。在中國知網以2000 年1 月1 日—2020 年4 月1 日為檢索時限，分別以“睡蓮花”“洋甘菊”“破布木果”“蜀葵子”為關鍵詞檢索文章，獲取各味藥材所含的化學物質。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為條件，分析篩選祖卡木顆粒的活性成分。利用TCMSP數據庫中的靶點預測功能，搜索祖卡木顆粒中活性成分主要作用的靶點，運用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/），通過導入蛋白名稱并限定物種為“Homo sapiens”，將檢索得到的所有蛋白靶點校正為Uniprot ID，并得到靶點蛋白所對應的基因。

1.2 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網絡的構建

將“1.1”項篩選的祖卡木顆粒中活性成分及其作用靶點基因名導入Cytoscape3.7.2 軟件，以此構建“藥材-成分-靶點”網絡。對祖卡木顆粒中每個藥材所含活性成分及其調控靶點進行可視化分析。

1.3 COVID-19 靶點的收集及潛在靶點預測

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）gene 數據庫，輸入關鍵詞為“Novel coronavirus”，選擇“Homo sapiens”為物種，得到COVID-19 相關基因。在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/），輸入關鍵詞為“Novel coronavirus”，檢索COVID-19 相關基因，使用Venny 2.1.0 軟件，將祖卡木顆粒的靶點與COVID-19的靶點進行映射，獲取祖卡木顆粒治療COVID-19 的潛在靶點。

1.4 蛋白相互作用網絡（PPI）及藥物-成分-靶點-疾病網絡

將“1.3”項獲得的靶點導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），以此構建潛在靶點蛋白相互作用網絡（PPI），通過Cytoscape3.7.2 軟件，構建藥物-成分-靶點-疾病網絡，對祖卡木顆粒治療COVID-19 的成分與靶點進行可視化分析，選取度值最大的9 個成分作為核心成分。

1.5 潛在靶點通路富集分析

為進一步觀察潛在靶點的生物學功能，使用Bioconductor 生物信息軟件包，利用Rx64 3.6.2 進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，并繪制成柱狀圖和氣泡圖。將潛在靶點與KEGG 信號通路導入Cytoscape3.7.2軟件，進行基因-通路網絡分析，篩選出關鍵靶點與顯著富集的信號通路并進行可視化。

1.6 核心成分-靶點分子對接

將“1.4”項下獲得的祖卡木顆粒核心成分分別與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 蛋白進行分子對接，分析其潛在結合位點。先從RSCBPDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 的3D 結構pdb 格式文件，用Mgltools1.5.6處理，通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成pdbqt 文件。在TCMSP 平臺下載核心成分的3D 結構，然后用Mgltools1.5.6 處理，通過加氫，計算電荷，合并非極性氫后保存成pdbqt 文件。分別將SARSCoV-2 3CL 結構原配體位置、ACE2 全局位點作為結合位點，設置Grid Box 坐標和盒子大小，運用Autodock vina.1.1.2 進行分子對接，PyMol 2.3.0 進行構象的處理。

2 結果

2.1 祖卡木顆粒中活性成分及其潛在靶點

通過“1.1”項研究，共獲得祖卡木顆粒中746 個化合物，再以OB≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，剔除不符合條件的成分，篩選出祖卡木顆粒中活性成分166 個，去掉重復后共獲得125 個活性成分。通過TCMSP 平臺檢索125 個活性成分的潛在靶點，借助Uniprot 數據庫對靶點及其對應的基因進行搜集與記錄，最終獲得祖卡木顆粒125 個活性成分和252 個靶點。

2.2 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網絡

通過“1.2”項研究繪制出藥材-成分-靶點網絡，網絡包含377 個節點和2067 條邊，見圖1。其中9 個共有成分，MOL000096（兒茶素）來自于大黃和大棗，MOL000098（槲皮素）來自于大棗、甘草、睡蓮花和蜀葵子，MOL000211（丁子香萜）來自于大棗和甘草，MOL000358（β-谷甾醇）來自于大黃、大棗、破布木果，MOL000359（谷甾醇）來自于薄荷和甘草，MOL000422（山柰酚）來自于甘草、山柰和蜀葵子，MOL000471（蘆薈大黃素）來自于薄荷和大黃，MOL000787（延胡索堿）來自于大棗和罌粟殼、MOL004328（柚皮素）來自于薄荷和甘草。

圖1 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點網絡

2.3 祖卡木顆粒治療COVID-19 潛在靶點預測

通過“1.3”項研究，運用NCBI 和GeneCards 數據庫進行檢索，分別得到COVID-19 的潛在靶點48 個和350 個，去掉重復后，最終得到COVID-19 相關靶點352 個。運用Venny 2.1.0 將祖卡木顆粒活性成分調控的252 個靶點與COVID-19 的352 個靶點取交集，得到50 個交集靶點，見圖2。

圖2 祖卡木顆粒治療COVID-19 靶點韋恩圖

2.4 祖卡木顆粒治療COVID-19 的PPI 網絡

將“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因導入到STRING 數據庫，得到潛在靶點的PPI 網絡見圖3，PPI 網絡包含50 個節點和654 條邊，其中八邊形節點表示靶點蛋白，度值表示節點的重要性，其中靶點節點度值中位數為28，平均節點度值為26.2，超過平均度值的靶點有27 個。

2.5 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網絡

尋找“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因在祖卡木顆粒中對應的活性成分，共得到50 個基因的114 個活性成分。將其導入Cytoscape3.7.2 中，得到祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網絡圖4，網絡包含164 個節點和501 條邊。圓形代表基因，三角形代表活性成分。選取度值最大的成分和基因作為核心成分與核心基因，由圖4 可見，核心基因有GTPS2、PPARG、MAPK14、NOS2、GTPS1 和DPP4 等，核心成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、金合歡素、甘草查爾酮、蘆薈大黃素、異鼠李糖和β-谷甾醇等。

圖3 祖卡木顆粒與COVID-19 交集靶點的PPI 網絡

2.6 潛在靶點通路分析

借助R 語言對“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因進行GO 富集分析，1876 項被顯著富集（P ≤0.05），其中生物過程1754 項，細胞組成33 項，分子功能89 項，前20 項顯著富集的生物過程、細胞組成和分子功能結果見圖5（封三）。

圖4 祖卡木顆粒藥材-成分-靶點-疾病網絡圖

圖5 祖卡木顆粒潛在靶點的GO 富集分析的前20 個通路（見內文第12 頁）

GO 富集分析主要集中在生物過程中，顯著富集主要涉及對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、細胞對生物刺激的反應（cellular response to biotic stimulus）等；細胞組成顯著富集主要涉及脂膜筏（membrane raft）、脂膜微結構域（membrane microdomain）和脂膜區（membrane region）；分子功能顯著富集主要涉及細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）等。

對“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因進行KEGG 通路富集分析，155 條信號通路（P ≤0.05）顯著富集，前20 條顯著富集信號通路結果見圖6（封三）。顯著富集的通路涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。

圖6 祖卡木顆粒潛在靶點KEGG 富集分析的前20 條通路（見內文第12 頁）

2.7 基因-通路網絡分析

將“2.3”項下獲得的50 個交集靶點基因與“2.6”項下獲得的KEGG 通路導入Cytoscape3.7.2 中，選取betweenness centrality（BC）大于中位數的節點，可視化得到祖卡木顆粒治療COVID-19 基因-通路網絡見圖7。內圈圓形代表基因，外圈圓形代表通路。網絡圖顯示MAPK1 的BC 最大，是調控信號通路的核心基因，其他幾個基因也有較大的BC，如MAPK3、RELA、MAPK8 等。他們可能是祖卡木顆粒治療COVID-19的主要基因。

2.8 分子對接

祖卡木顆粒中核心成分與SARS-CoV-23CL 水解酶和ACE2 結合能均＜-5.0 kJ/mol。由此可見祖卡木顆粒中的核心成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和ACE2 形成構象能量低，結構穩定，結合活性較高，可能是祖卡木顆粒治療COVID-19 的主要成分。見表1。

槲皮素、山柰酚、木犀草素與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 構象見圖8。由圖可見，槲皮素與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結合位點為SER-144，LEU-141、ARG-188、CYS-145、HIS-163，山柰酚與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結合位點為ASP-187、TYR-54、SER-144，木犀草素與SARS-CoV-2 3C 水解酶的結合位點為GLY-143、HIS-163、SER-144、CYS-145；槲皮素與ACE2 結合位點為GLU-406、ARG-518、GLU-402、HIS-374，山柰酚與ACE2 結合位點為GLU-402、ARG-518、HIS-374、HIS-345，木犀草素與ACE2 結合位點為GLU-406、ASN-277。

3 討論

分子對接結果顯示槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、金合歡素、甘草查爾酮和蘆薈大黃素等成分可能是祖卡木顆粒治療COVID-19 的潛在物質基礎。研究發現，槲皮素具有抗病毒、抗炎和免疫調節等藥理作用[12]，可能參與基于白細胞介素（IL）-6、IL-1β 調控的NF-κB 信號通路（hsa04064）對支氣管炎起到治療作用[13]，參與CASP3 調控的細胞凋亡信號通路（hsa04210）發揮抗病毒作用[14]，這與本研究“2.7”項下結果一致。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗骨關節炎和免疫調節等多種藥理活性[15]，是祖卡木顆粒質量控制主要成分之一，山柰、蜀葵子和甘草藥材中均含有山柰酚成分，其通過IL-6 等炎癥因子參與機體對抗急性和慢性炎癥[16-17]。木犀草素和柚皮素具有抗病毒、抗炎等作用[18-19]。金合歡素與糖分子結合形成的黃酮苷類化合物金合歡素-7-O-葡萄糖苷通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和VCAM-1 調控NF-κB的激活[20-22]。甘草查耳酮通過抑制一氧化氮合成和IL-6 的產生從而調控NF-κB 信號通路發揮抗炎、抗氧化和免疫調節作用[23]。蘆薈大黃素具有阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤細胞轉移作用，是一種重要的抗腫瘤藥物[24-25]。綜上所述，祖卡木顆粒中篩選出的活性成分主要有抗病毒、抗炎、免疫調節及抗腫瘤等作用，可能在治療COVID-19 時發揮抗病毒、抗炎及免疫調節的作用。

圖7 祖卡木顆粒治療COVID-19 基因-通路網絡

表1 祖卡木顆粒中核心成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的結合能（kJ/mol）

基因-通路網絡分析顯示，MAPK3、RELA、MAPK8、PRKCB、PRKCA、IL-6、TP53、MAPK14 和IL1B 是富集比較顯著的基因，其中絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）在病毒感染的環境應激下被激活，MAPK3，MAPK1 和MAPK8 對細胞炎癥反應和腫瘤細胞的增殖、分化、轉化和凋亡的調控均有顯著影響[26-27]。RELA以一種弱的結合方式結合在NF-κB 復合物中，可以直接參與DNA 結合，除了可以直接激發轉錄激活劑的活性外，它還能夠調節啟動子對轉錄因子的可及性，從而間接調節基因表達；通過與DDX1 的結合與NFκB 啟動子區的染色質結合，對T 細胞中細胞因子基因表達至關重要[28]。NF-κB 同二聚體RELA-RELA 復合物可能參與了侵襲素介導的IL-8 表達激活。PRKCB 通過調節BCR 誘導的NF-κB 活化在B 細胞活化中起關鍵作用。通過直接磷酸化SER-559、SERr-644 和SER-652 處的CARD11/CARMA1，介導NF-κB 途徑（NF-κB1）的激活[29]。文獻報道動態觀察IL-6 水平有助于了解感染性疾病的進展和對治療的反應，IL-6 水平在正常組與治療組的水平規律為正常組＜輕癥組＜重癥組，在發布的《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》中，IL-6 已經被定為病情惡化的臨床警示指標[30-32]。祖卡木顆粒50 個潛在靶點主要涉及病毒感染、炎癥反應、免疫調節等方面。

在前20 條顯著富集的KEGG 信號通路中，與病毒感染相關的有12 條，分別為甲型流感、百日咳、利什曼病、乙型肝炎、丙型肝炎、肺結核、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、麻疹、人類免疫缺陷病毒-1 感染、人乳頭瘤病毒感染和Epstein-Barr 病毒感染，這預示著祖卡木顆粒在抗病毒中發揮重要的作用。

圖8 槲皮素、山柰酚、木犀草素與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2 的分子對接模式