加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8/SVneo細胞內質網應激JNK信號通路的凋亡作用

簡詠男 鄭文蘭

1.貴州中醫藥大學研究生院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，貴州貴陽 550000

異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）是指孕卵在子宮體腔以外著床，其中輸卵管妊娠最為常見，占95%左右[1]。隨著患者逐漸年輕化及二孩政策的開放，要求保留生育功能的患者增多[2]，因此中醫藥的應用也受到了相應的重視。加味宮外孕Ⅱ號方治療EP 在貴州中醫藥大學第一附屬醫院應用多年，其臨床療效好，前期研究表明該方有破壞滋養細胞超微結構、誘導細胞凋亡的作用[3]，但殺胚的具體機制尚不清楚。據文獻報道，通過內質網應激（ERS）誘導細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導通路，許多疾病的防治都與過度ERS 引起的細胞凋亡有關[4]，但加味宮外孕Ⅱ號方是否通過ERS 途徑發揮藥效來治療EP 尚未見報道。本研究以人絨毛膜滋養層細胞株（HTR-8/SVneo）細胞作為研究對象，采用Western blot 及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法，探討加味宮外孕Ⅱ號方對滋養細胞凋亡的相關機制，為臨床上加味宮外孕Ⅱ號方保守治療EP 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

SPF 級SD 健康雌性大鼠36 只，體重180～220 g，購于湖北省實驗動物研究中心，本實驗通過湖北省實驗動物管理與使用委員會批準（20182901），實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，每次灌胃前禁食12 h，不禁水，給藥2 h 后恢復食物；HTR-8/SVneo購于華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院。

1.2 實驗藥物

加味宮外孕Ⅱ號方（丹參15 g、赤芍15 g、桃仁9 g、三棱9 g、莪術9 g、蜈蚣4 g、全蝎6 g、土鱉蟲10 g、紫草25 g）由貴州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，水煎濃縮成3 g/mL 的藥液，4℃保存備用；甲氨喋呤：廣東嶺南制藥有限公司，批號：872016。

1.3 主要儀器及試劑

qRT-PCR 儀（美國ABI）；離心機（湖南湘儀）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司；P0010）；逆轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Q111-02）；引物合成（武漢擎科生物技術有限公司）；兔抗GAPDH 一抗（杭州賢至生物科技有限公司；AB-P-R 001）；兔抗IRE1一抗（武漢三鷹生物技術有限公司；27528-1-AP）；兔抗TRAF2、ASK1 一抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司；BA1444-2、BM4220、BA1054）；兔抗JNK1、JNK2、p-JNK 一抗（英國Abcam；ab199380、ab76125、ab4821）。

1.4 含藥血清的制備

36 只大鼠適應性飼養1 周后，采用隨機數字表法分為六組，即陰性對照組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥結合組，每組6 只。由人與大鼠等效劑量換算，以成人（體重以60 kg 計）每日用藥量的等效劑量比1∶7[5]為加味宮外孕Ⅱ號方低劑量組給藥劑量，低劑量的2 倍為中劑量組，低劑量的4 倍為高劑量組給藥劑量，即加味宮外孕Ⅱ號方低、中、高灌胃劑量分別為12、24、48 g/（kg·d）；陰性對照組予中藥中劑量等體積的生理鹽水灌胃；西藥組予中藥中劑量等體積的生理鹽水灌胃，并在取血前1 h 一次性肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg；中西藥結合組予中藥中劑量灌胃，并在取血前1 h 一次性肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg。中藥及生理鹽水灌胃為1 次/d，連續8 d；西藥1 次為1 個療程。于末次給藥1 h 后在麻醉下行心臟采血，將取得的血液標本靜置2 h，3000 r/min離心10 min，離心半徑為12.5 cm，吸取血清，微孔濾器過濾，水浴滅活，將同組血清混合，各組分裝，-80℃冰箱保存。

1.5 細胞培養和干預

將HTR-8/SVneo 細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）+1%青鏈霉素（penicillin-streptomycin solution）的1640 培養基中，細胞培養條件為37℃恒溫培養，二氧化碳濃度為5%，待細胞的密度達到80%時，用胰蛋白酶消化傳代。取第5 代對數生長期的HTR-8/SVneo 細胞隨機分為七組，即空白對照組，陰性對照組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥結合組，培養24 h。再將各組別的含藥血清分別與相對應組別的細胞共培養，24 h 后收集細胞用于后續實驗。空白對照組為未用血清處理的細胞，以排除血清成分復雜所帶來的干擾。

1.6 Western blot 法

Western blot 法測定IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達，具體參照前期課題組方法[6]。

1.7 qRT-PCR 法

qRT-PCR 法 測 定IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 基因表達具體，參照前期課題組方法[6]。引物序列及產物大小詳見表1。

1.8 統計學方法

采用SPSS 25.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間均數兩兩比較采用LSD 及S-N-K 分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較

與空白對照組比較，陰性對照組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與陰性對照組比較，中藥各劑量組、西藥組及中西藥結合組除JNK1、JNK2 外，IRE1α、TRAF2、ASK1、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組中TRAF2 蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P ＜0.05），在中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組中TRAF2 蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組中ASK1 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05），西藥組及中西藥結合組ASK1 蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組IRE1α、TRAF2、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥高劑量組比較，西藥組TRAF2 蛋白表達量增加，差異有統計學意義（P ＜0.05），中西藥結合組TRAF2 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與中藥高劑量組比較，西藥組及中西藥結合組IRE1α、ASK1、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與西藥組比較，中西藥結合組IRE1α 蛋白表達量無明顯變化，差異無統計學意義（P ＞0.05），ASK1 蛋白表達量增加，差異有統計學意義（P ＜0.05），而TRAF2、p-JNK 蛋白表達量均減少，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見圖1、表2。

表1 基因引物序列及大小

2.2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較

圖1 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達的電泳圖

與空白對照組比較，陰性對照組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與陰性對照組比較，中藥各劑量組、西藥組及中西藥結 合 組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組中TRAF2、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05），中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組TRAF2、JNK2 mRNA 表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組IRE1α、ASK1、JNK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組ASK1 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05），西藥組和中西藥結合組ASK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結合組IRE1α、TRAF2、JNK1、JNK2 mRNA表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；與中藥高劑量組比較，西藥組和中西藥結合組IRE1α、JNK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），西藥組和中西藥結合組TRAF2、ASK1、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05）；與西藥組比較，中西藥結合組IRE1α、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表達量無明顯變化（P ＞0.05），TRAF2 mRNA 表達量減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較（±s，n=3）

表2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較（±s，n=3）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，★P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，◆P ＜0.05；與西藥組比較，△P ＜0.05

表3 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較（±s，n=3）

表3 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較（±s，n=3）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，★P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，◆P ＜0.05；與西藥組比較，△P ＜0.05

3 討論

細胞凋亡為細胞的程序性死亡，凋亡過程受細胞內一系列分子的調控[7]。MAPK 為一類絲蛋白/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內外信號傳導的主要傳導分子之一[8]。JNK 信號通路是MAPK 家族主要成分之一，在細胞凋亡中也是重要的信號通路，與多種疾病發生發展密切相關[9-13]。已有研究表明，JNK 信號通路參與了過度ERS 所引發的細胞凋亡[14]。最新研究表明ERS 是誘導細胞凋亡的關鍵分子機制，現階段研究認為ERS 發生的主要原因是內質網折疊蛋白功能異常，導致錯誤蛋白在內質網內堆積，短時間的ERS 是細胞自我修復的一種方法，但長期ERS 發生即可引起細胞凋亡[15-16]。ERS 需3 種內質網跨膜蛋白即PERK、IRE1 和ATF6介導[17]。

IRE1 是ERS 的傳感器，它可以將內質網的應激信號傳遞給細胞質和細胞核[18]，其自身具有核酸內切酶活性，IRE1α 是其中一種亞型，廣泛存在于各種細胞中[19]。在非ERS 條件下，IRE1α 與內質網分子伴侶結合在一起，處于無活性的狀態。當內質網內異常折疊的蛋白聚集引起ERS 反應時，內質網分子伴侶就會與IRE1α 解離，活化后的IRE1α 可以募集TRAF2，IRE1α 與TRAF2 共同激活ASK1，形成IRE1α/TRAF2/ASK1 三聚體，可促使JNK 的磷酸化激活形成p-JNK[20]，最終導致細胞凋亡。Chen 等[21]認為IRE1 是決定細胞生存或者凋亡的關鍵，因此可通過檢測IRE1α 來判斷是否發生了過度ERS，那么，在HTR-8/SVneo 細胞中是否也存在內質網跨膜蛋白IRE1α 的激活呢？鄧高丕課題組認為體外培養的輸卵管妊娠滋養細胞與正常宮內早孕滋養細胞相似，故選用HTR-8/SVneo 細胞進行研究[22]。為了排除大鼠含藥血清對實驗結果的干擾，故設未用含藥血清處理的細胞作為空白對照組。本實驗研究運用Western blot 及qRT-PCR技術檢測加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8/SVneo 細胞JNK信號通路各凋亡調控因子蛋白及mRNA 的影響。結果顯示，陰性對照組和空白對照組結果各指標比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），提示含藥血清未對實驗造成干擾，與陰性對照組比較，無論是中藥各劑量組、西藥組還是中西藥結合組，HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α 蛋白及mRNA 均高水平表達，說明加味宮外孕Ⅱ號方和甲氨蝶呤均能通過持續激活IRE1α 進而誘發細胞發生過度ERS。與陰性對照組比較，中藥及西藥組處理后的HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、p-JNK 蛋白與IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 的表達量均上調，說明經加味宮外孕Ⅱ號方和甲氨蝶呤干預后，HTR-8/SVneo 細胞內JNK 信號通路被激活，活化的JNK 通路可誘導細胞凋亡[23]。因此，加味宮外孕Ⅱ號方治療EP 的機制可能與加味宮外孕Ⅱ號方能激活ERS JNK 信號通路，進而促進細胞凋亡有關。中藥及西藥組處理后的HTR-8/SVneo細胞中JNK1、JNK2 蛋白表達與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），但基因表達增加，考慮可能是因為JNK1、JNK2 剪切激活時受到了抑制[24]。另外中藥低、中、高劑量組IRE1α、p-JNK 蛋白和IRE1α、JNK1 mRNA 表達量逐漸增加，且P ＜0.05，提示中藥各劑量組可能呈劑量相關性，劑量越高，促凋亡作用越強，此結果與鄭文蘭等[25]研究結果一致，對指導臨床用藥劑量的選擇具有參考價值。

此外，從本研究結果看，單純西藥組在上調IRE1、TRAF2、p-JNK 蛋白表達上優于單純中藥組和中西藥結合組，且P ＜0.05，提示JNK 信號通路中甲氨蝶呤發揮促凋亡的作用最強。而本課題組前期研究中，加味宮外孕Ⅱ號方在Caspase-12 通路中促細胞凋亡作用最好[6]。此差異性說明加味宮外孕Ⅱ號方誘導細胞凋亡可能存在不同的分子機制，還可能受到其他凋亡通路的調控，故JNK 通路并不是加味宮外孕Ⅱ號方誘導細胞凋亡的唯一通路。

綜上所述，本研究顯示加味宮外孕Ⅱ號方含藥血清可以促進HTR-8/SVneo 細胞凋亡，JNK 信號通路的激活可能是其中的機制之一。