基于UPLC-Q-TOF-MS 技術的阿司匹林抵抗血清代謝組學研究*

蔣志濤，呂玲燕，韓 怡，倪 磊

南京中醫藥大學附屬張家港醫院藥學部，張家港 215600

阿司匹林抗血小板功效顯著，常用于心血管疾病（cardiovascular disease，CVDs）的一級和二級預防。從20 世紀90 年代以來，臨床上出現有部分患者使用阿司匹林后并沒有達到預期治療效果，稱之為“阿司匹林抵抗”（aspirin resistance，AR）[1]。鑒于阿司匹林是改善患者CVD 結局干預措施的關鍵物質，有發生CVD 事件風險的患者如果出現AR 就是重要的臨床問題。同時AR 患者的心血管事件發生率和死亡率顯著增加，Gum PA 等[2]研究了326 例使用阿司匹林的穩定性CVD 患者，其中有17 例（5.2%）出現AR，平均隨訪1.9 年后，AR 患者的復合終點（死亡、心肌梗死或腦卒中）發生率為24%，顯著高于其余患者的10%。目前尚不完全清楚AR產生的機制，研究顯示，其主要的影響因素包括用藥依從性差、阿司匹林藥代動力學變化、與其他藥物相互作用、血小板活性上調、非血小板COX-1 來源的血栓素A2 生成增多、藥物治療靶點變化等[3]。

現有的AR 治療措施主要為調整藥物劑量、服藥時間、控制基礎疾病等，臨床效果并不顯著。中醫藥干預AR 治療具有獨特的優勢。馬衛琴等[4]研究了87 例AR 患者的體質類型，其中以血瘀、氣虛體質較為常見。陳光等[5]研究多項中醫藥臨床干預AR，結果顯示血瘀既是AR 的病因，也是AR 的病理產物，血瘀證與AR 緊密相關。還有研究表明，AR 最終將導致血瘀證的出現[6]。本研究運用超高效液相色譜-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術尋找AR相關的潛在生物標志物，為后期深入探討“藥物改善AR 的作用機理”打下基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC TM 型超高效液相色譜儀和Xevo G2-XS 型飛行時間質譜（美國Waters 公司）；AE240 電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 藥物與試劑

阿司匹林腸溶片（拜阿司匹林，批號BJ40031，拜耳醫藥保健公司）；布洛芬緩釋膠囊（芬必得，批號18010587，中美天津史克公司）；硫糖鋁咀嚼片（批號227004，重慶科瑞制藥）；乙腈、甲酸、甲醇為色譜純；醋酸銨為分析純；超純水。

1.3 動物

雄性金黃地鼠（SPF 級）80 只，6～8 周齡，體重120～140 g，購于南京青龍山動物養殖場，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0001。

2 方法與結果

2.1 金黃地鼠分組及AR 模型建立

參考唐世英等[7]金黃地鼠高脂血癥動物模型研究，將金黃地鼠隨機分為空白組（A 組，n=12）、阿司匹林抵抗模型組（B 組，n=12）。A 組自由餐食飲水；B 組給予飼料（高脂高鹽高糖）喂養12 周。具體造模方式為：第9 周開始每天早上8 時給予B 組金黃地鼠硫糖鋁（14.8 g·kg-1）灌胃一次，下午1 點給予B 組阿司匹林（0.74 g·kg-1）和布洛芬（2.22 g·kg-1）混合灌胃一次，藥物劑量隨金黃地鼠體重變化而每1 周調整一次。同時第9 周開始每天下午4 時將B 組金黃地鼠置于10 m2密閉實驗室內，點燃香煙15 支，持續30 min。

模型判斷標準：B 組金黃地鼠第12 周禁食12 h后，于腹主動脈取血進行檢測，檢測結果：甘油三酯＞0.8 mmol·L-1、血清總膽固醇＞1.6 mmol·L-1，表明高脂血癥模型成功。該金黃地鼠再進行血小板聚集檢測[8]，其中血小板平均聚集率既符合腺苷二磷酸鈉鹽誘導下≥70%，又符合花生四烯酸誘導下≥20%，則認為其屬于AR 造模成功。

2.2 血清樣本采集與處理

采用腹主動脈取血法。為了減少采血對金黃地鼠體內內源性物質的干擾，采集空腹血樣進行代謝組學分析。采血方法為：第12 周末，將所有金黃地鼠禁食12 h，10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔麻醉，仰臥位固定，開腹主動脈取血4 mL，以2 mL 全血供血小板聚集檢測，2 mL 置于醫用血清管中，3000 r·min-1離心20 min，取上層血清于-70 ℃保存，供UPLC-Q-TOF-MS 分析。

分析前于室溫下解凍血清，渦旋30 s，取200 μL 樣品加入1.5 mL EP 管中，而后加入800 μL 預冷的甲醇（4 ℃），渦旋30 s 后，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，放置于離心濃縮儀35 ℃離心揮干，50%甲醇100 μL 復溶，4 ℃下12000 r·min-1離心10 min，吸取50 μL 于進樣小瓶中待測。

為保證分析系統的穩定性，采用質量控制（quality control，QC）樣品進行方法驗證。QC 樣品是由每個樣品各取40 μL 復溶液混合而得，為降低誤差，樣品檢測為隨機進行。在對樣品分析前，先運行5 次QC 樣品以平衡系統，在檢測過程中，每檢測5個樣品后運行1 次QC 樣品，以衡量系統的穩定性。

2.3 色譜條件

采用Acquity UPLCTM BEH C18色譜柱（2.1mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1，采用梯度洗脫的方式運行15 min。每次進樣5μL，自動進樣器溫度設定4℃。正離子檢測：A 流動相=99.9%乙腈、0.1%甲酸；B 流動相=99.9%水、0.1%甲酸。負離子檢測：A 流動相=90%乙腈、10%水，10 mmol 醋酸銨，氨水調節pH 至9；B 流動相=5%乙腈、95%水，10 mmol 醋酸銨，氨水調節pH 至9。洗脫程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.5 min，3～20% B；1.5～6 min，20～60% B；6～9 min，60～95% B；9～12 min，95% B；12～12.1 min，95～3% B；12.1～15 min，3% B。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）采用正、負離子掃描模式，毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓30V，碰撞能電壓6eV，離子源溫度120 ℃，除溶劑溫度350 ℃，除溶劑氣體流為700 L·h-1氮氣，采集范圍m/z 100～1000，碰撞氣體為氦氣。

質譜正離子掃描，全掃描范圍m/z 70～1050。全掃描中選擇離子強度TOP15 的母離子進行二級質譜鑒定。質譜負離子掃描，全掃描范圍m/z 70～1050。全掃描中選擇離子強度TOP15 的母離子進行二級質譜鑒定。

2.5 系統穩定性檢測

運用UPLC-Q-TOF-MS 代謝組學研究，穩定的實驗方法才能獲得可靠的實驗數據。每隔4 個樣品分析QC 樣品和空白樣品，以檢驗分析方法的穩定性和色譜上樣量。

2.6 數據處理和統計分析

獲取UPLC-Q-TOF-MS 指紋圖譜后，采用Analyst?TF 1.7 Software 導出原始數據，可以存儲到與每份樣品對應的獨立的文件中，PeakView 將異常的峰去掉；Markview 進行峰對齊。最終獲得包含質荷比、保留時間和峰面積三維數據表，利用QC 樣品對所有峰進行校正，將校正后的數據導入Simca-P v13.0 和EZinfo 3.0 進行多維統計分析，以便篩選出變量。采用主成分分析（PCA）得分圖，直觀地表示組與組之間的差異，通過偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，篩選前后變化顯著的差異代謝物，使用SPSS 16.0 軟件進行統計學處理，兩組間差異顯著性比較采用t 檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。將找到的潛在差異代謝物在HMDB（human metabolome databatabase）、METLIN 和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫進行檢索與確認，得到最終匹配差異代謝物。

2.7 主成分分析

在正、負離子模式下，血清及QC 樣品PCA 得分圖見圖1。將經過校正后的質譜數據，采用PCA法研究阿司匹林抵抗血清代謝物譜圖模式變化，獲得三組血清樣本在空間上的分布情況。圖1 同一顏色代表相同癥狀研究組，相同顏色越集中說明同一癥狀個體差異小，越分散表明個體差異大。PCA 結果表明，正、負離子模式下，QC 樣品的聚集狀況均良好，表明系統的穩定性良好。AR 組和對照組盡管有部分交叉重疊，但有一定的分離趨勢。

圖1 血清及QC 樣品正（A）、負（B）離子模式下的主成分分析得分圖

2.8 偏最小二乘法及置換檢驗

為消除與研究目的無關的隨機誤差及組內誤差，對UPLC-Q-TOF-MS 數據采用有監督的PLS-DA方法再次進行分析。PLS-DA 由PCA 演變而來的雙線性回歸模型，能夠忽略次要因素對結果的不利影響，提高判別分析的能力，有助于確定兩組間的差異成分，從而識別有效的標志物，不同顏色符號在此種建模中分散的越開，說明兩組間的成分差異越顯著。本研究PLS-DA 得分圖見圖2，其顯示AR 組與對照組分離明顯，說明兩組間存在一定差異。PLS-DA 正、負離子模式的模型參數分別為R2Y=0.929，Q2=0.435；R2Y=0.978，Q2=0.673；表明模型有效。進一步對模型進行響應置換檢驗，100 次隨機改變后建立對應數據的PLS-DA 模型，以獲取模型的R2和Q2值。在兩種模式下，R2=0.932，Q2=0.201；R2=0.954，Q2=0.137；說明建立的模型符合樣本數據的真實情況，不存在過擬合現象，模型穩健性良好。

2.9 差異代謝物的篩選[9]

本研究使用PLS-DA 模型中VIP 值參數，結合t 檢驗進行組間比較，篩選潛在的差異代謝物，VIP值是兩組中含量顯著改變的代謝物值，VIP 值＞1 并P＜0.05 時，顯示對應的代謝物是差異性代謝物。針對組間的比對情況，在金黃地鼠不同組血清樣本中找到主要差異性代謝物，其中倍數變化（fold change，FC）代表不同組血清代謝物含量的比值，FC≥1.5 表明不同組血清中該代謝物質相比正常組含量上升，表達為上調代謝物，FC≤2/3 表明不同組血清中該代謝物質含量下降，表達為下調代謝物。通過搜索ChemSpide、MassBank、MetFrag 和Metlin等數據庫，結合質譜數據鑒定差異代謝物。結果表明與對照組相比，AR 組有脫氧膽酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等11 個特異性代謝分子，其信息見表1。代謝物通路分析提示，與脂肪酸生物合成、二次膽汁酸生物合成、氨基酸代謝等密切相關。

圖2 對照組和AR 組正、負離子模式下最小二乘法判別分析

表1 主要差異代謝物信息

3 討論

AR 的病理生理過程十分復雜，目前其機制尚未闡明。代謝組學技術的應用，為從代謝的視角揭示AR 病理生理學過程的變化，以及它們包含的生物學意義提供了新的工具和方法。本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 技術比較了AR 大鼠與正常大鼠血清化學成分的變化。模型組大鼠血清中含有各類小分子代謝物，包括氨基酸、脂肪酸、膽汁酸等，且部分在含量上與對照組有明顯差異，這些物質參與了多種生理生化過程，特別是脂代謝和膽汁酸代謝。

脫氧膽酸是膽酸失去一個氧原子衍生而得的一種游離膽汁酸，膽汁酸促進脂類物質的消化與吸收，是體內膽固醇的主要代謝去路，膽固醇轉化為膽汁酸的代謝途徑異常可導致高膽固醇血癥，進而參與動脈粥樣硬化的發生、發展。臨床研究證明，膽汁酸與血脂代謝紊亂、冠心病及腦血管疾病關系密切，有可能是冠心病的獨立危險因素[10]。

心肌在正常狀態下，脂肪酸氧化是其能量代謝的主要形式，心肌缺血缺氧時，脂肪酸代謝異常，表現為脂肪酸氧化減弱，中間產物堆積，心肌內血清游離脂肪酸水平升高，其中硬脂酸是長鏈脂肪酸氧化的中間產物。模型組樣本中硬脂酸含量升高，提示AR 導致脂肪酸氧化速率下降，心肌能量代謝異常。

目前中醫藥干預AR 的研究主要集中于臨床研究，一些單味中藥（銀杏、丹參、三七等）及中成藥（復方丹參滴丸、通心絡膠囊、護心膠囊等）均報道對預防及治療AR 效果顯著，但機制研究較少。范英華等[11]研究發現，丹酚酸A 可有效抑制多種誘導劑（ADP、花生四烯酸等）誘導的大鼠血小板聚集，并能顯著升高血小板中cAMP 的含量，其機制與cAMP多條GPCRs 信號通路有關。賴潤民等[12]通過網絡藥理學研究發現，丹紅注射液改善AR 機制涉及凝血過程、炎癥反應、代謝調節的21 條通路。

本研究顯示，AR 組有11 個差異代謝物：脫氧膽酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等，為AR 的潛在生物標志物，提示AR 致病機理可能與脂肪酸生物合成、二次膽汁酸生物合成、氨基酸代謝有關，這為今后深入探討中藥改善AR 的作用機理提供理論數據。