UPLC-MS/MS 法同時檢測人血清中5 種微量內源性激素*

楊 娜，劉紫薇，王 敏，朱懷軍，葛衛紅**

1 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，南京 210008；2 中國藥科大學，南京 210009

性激素檢測是臨床實驗室檢測項目中公認的難題，主要原因是其在血液中含量極低（通常在pmol·L-1水平）[1]，且結構類似物眾多[2]，因此對方法的敏感度和特異度要求很高。在現階段臨床檢測中免疫法多用于性激素的檢測；但由于其易受其他內源性類固醇、脂質和基質效應的干擾，對血清中微量性激素測定的特異性和可靠性仍然存在疑惑。

在性激素檢測中，雄激素、孕激素的檢測對于臨床包括多囊卵巢綜合征[3]、不孕癥[4]、高雄激素血癥[5]等諸多疾病的診斷具有重要意義。然而，在臨床研究中發現，傳統免疫法用于高雄激素血癥的差錯率可高達1/3[3]。而質譜法由于其高靈敏度和特異性的優點，檢測具有較高的準確性。本研究旨在建立快速、靈敏度高、穩定性好的UPLC-MS/MS 分析方法，用于同時檢測人血清中包括睪酮（testosterone，T）、雄烯二酮（androstenedione，AD）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、孕酮（progesterone，P）和17α-羥孕酮（17-α-hydoxy progesterone，17α-OHP）等在內的5 種內源性激素。本方法為臨床血清樣本的檢測及相關疾病的診斷和研究提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 孕酮（P，純度99.7%，批號：G130207）、17α-羥孕酮（17α-OHP，純度99.5%，批號：G986202）、睪酮（T，純度99.2%，批號：G157843）、雄烯二酮（AD，純度99.3%，批號：G158946），均為德國DR.E 公司產品；脫氫表雄酮（DHEA，純度99.9%，批號：00004099-176,美國ChromaDex）；孕酮-d9[Pd9（IS），內標，純度98%，批號：8-GBH-69-3，加拿大TRC 公司]；鹽酸羥胺（純度99%，上海麥克林生化科技有限公司）；叔丁基甲醚（阿拉丁公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；純化水。

1.1.2 主要儀器 ACQUITY UPLC I-Class/XEVO TQD 超高效液相質譜聯用儀（美國Waters 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相：水相（A）：0.1%甲酸水，有機相（B）：乙腈（梯度洗脫程序：0.0～0.5min，40%B；0.5～3.0 min，40%～90%B；3.0～3.1 min，90%～40%B；3.1～5.0 min，40%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；整個運行時間：5 min；進樣體積5 μL。

1.2.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式掃描；多重反應監測（MRM）；毛細管電壓為3.5 kV；脫溶劑氣為氮氣，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為850 L·h-1；錐孔氣流速為50 L·h-1；離子源溫度為150 ℃；碰撞氣為氬氣；儀器工作站為MassLynx（version4.1）。各種相關離子見表1。

表1 MRM 模式離子參數

1.2.3 儲備液和標準溶液配制 分別精密稱取T、AD、DHEA、P、17α-OHP 對照品和同位素標記的內標P-d9（IS）粉末2 mg，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，顛倒搖勻配制成終濃度為200 μg·mL-1的儲備液，-20 ℃儲存。分別取各類激素儲備液，依次用甲醇梯度稀釋，分別配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1的激素混合標準溶液。取內標P-d9儲備液，用甲醇溶液逐級稀釋至10 ng·mL-1的內標溶液。

鹽酸羥胺溶液的配制：精密稱取鹽酸羥胺適量，采用50%甲醇-水溶液（v/v），配制成濃度為100 mmol·L-1的鹽酸羥胺溶液，置于-20 ℃儲存。

1.2.4 空白血清的制備 取空白血清50 mL，按1%比例加入葡聚糖-活性炭，于37 ℃搖床振搖5 h 后4000 r·min-1離心15 min，得上清液于12000 r·min-1低溫超速離心20min，取上層澄清液，即為空白血清。

1.2.5 血清樣品的處理方法 取300 μL 血清樣本，加入20 μL P-d9內標溶液（10 ng·mL-1）混勻，加入1.5 mL 甲基叔丁基醚溶液渦旋振蕩10 min，并在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉移上層有機相1.2 mL于真空濃縮裝置中，40 ℃揮干。加入100 μL 鹽酸羥胺溶液（100 mmol·L-1）于60 ℃水浴加熱30 min 作衍生化。取出在冰浴靜置，在4 ℃下12000 r·min-1離心5 min，轉移上清液于進樣瓶中，以5 μL 進樣分析。

2 結果

2.1 分析方法優化

2.1.1 質譜條件優化 采用濃度為200 ng·mL-1的標準溶液，進行衍生化后，對T、AD、DHEA、P、17α-OHP 及內標的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量進行逐一優化和確認，得到最佳的錐孔電壓和碰撞能量。見表1。

通過對比峰強度，對離子源溫度、脫溶劑氣流量等進行逐步優化，使目標化合物具有最高靈敏度。5 種激素經衍生化處理后，極大提高了離子化效率，當進入質譜均能產生響應強度高且穩定性好的[M+H]+分子離子峰。

2.1.2 液相條件優化 分別采用甲醇和乙腈為有機相，進行梯度或等度洗脫條件的摸索，并對不同色譜柱的峰形進行對比考察。結果顯示，以“1.2.1”色譜條件進行梯度洗脫，5 種激素和內標均顯示良好的峰形，且具有較高靈敏度。本法在UPLC 液相系統下，分析時間為5 min，能夠快速高效地分析目標雄激素和孕激素，達到較好的效果。

2.1.3 樣品處理優化 采用葡聚糖-活性炭法能夠高效去除人血清中內源性雌激素的干擾。血清樣本前處理摸索試驗發現蛋白沉淀法雜質干擾多，基質效應較高。液-液萃取法中叔丁基甲醚萃取法具有較好的提取回收率，目標激素的提取回收率變異均能控制在15%以內，并能保證較低的基質干擾。此外，本實驗通過對衍生化的溫度、時間、試劑濃度等進行優化，得到了理想的衍生化條件。

2.2 方法學驗證

2.2.1 特異性 按“1.2.5”項下方法處理空白血清樣本和加入各類激素對照品血清樣本，如圖1 所示。T、AD、DHEA、P、17α-OHP 和IS 的保留時間分別為2.04、1.99、1.92、2.55、1.98 和2.53 min。

圖1 UPLC-MS/MS 測定各激素及內標的典型色譜圖

各待測物和內標峰形良好，空白血清在各激素離子通道下無干擾，各激素在該方法下特異性良好。

2.2.2 標準曲線和定量下限 取空白血清270 μL，分別加入含T、AD、DHEA、P、17α-OHP 混合標準溶液30 μL，使其血清中濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1，每個濃度3 個樣本。按“1.2.5”項下方法處理樣本，以檢測目標激素峰面積和內標峰面積的比值為縱坐標Y，血清中各激素濃度為橫坐標X（pg·mL-1），用加權最小二乘法計算回歸方程（權重1/X）。得到各激素的標準曲線方程：T，Y=5.3×10-3X+0.13（r=0.9998）；AD，Y=2.9×10-3X+0.081（r=0.9996）；DHEA，Y=5.0×10-4X+0.029（r=0.9994）；P，Y=1.7×10-3X-0.0085（r=0.9991）；17α-OHP，Y=1.3×10-3X+0.013（r=0.9998）。

各激素在0.05～100 ng·mL-1范圍內具有良好的線性，定量下限（LLOQ）均為50 pg·mL-1（S/N>10）。

2.2.3 精密度和準確度 取空白血清分別配制3 批含LLOQ，低、中、高濃度（0.05、0.1、2、80 ng·mL-1）的混合激素的血清樣品，每個濃度平行6 份，按照“1.2.5”項下方法處理樣本，分3 天連續檢測，計算日內與日間精密度、準確度。由結果可知，精密度（RSD）與準確度（RE）均在15%以內，符合生物樣本測定要求。見表2。

表2 精密度和準確度（n=6）

2.2.4 提取回收率和基質效應 配制含有終濃度為0.1、2、80 ng·mL-1混合激素的血清樣本各6 份，按“1.2.5”項下方法處理血清樣本，記錄各激素峰面積A1和內標峰面積AIS1。另取空白血清，經甲基叔丁基醚萃取后、加入各激素混合標準溶液和內標溶液，處理后測得各激素峰面積A2和內標峰面積AIS2。取各激素混合標準溶液加入內標溶液后處理進樣，測得各類激素的峰面積A3和內標峰面積AIS3。計算峰面積比值：f1=A1/AIS1，f2=A2/AIS2，求得同一濃度樣本的比值平均值（f2）mean。計算相對提取回收率=f1/（f2）mean，并計算內標歸一化基質因子=（A2/A3）/（AIS2/AIS3）及其RSD（%），結果見表3。

在5 種激素低、中、高濃度水平下，平均提取回收率在78.7%～106.8%，歸一化基質因子在94.2～114.9。相對提取回收率和基質效應因子的RSD均＜15%，符合生物樣本定量分析要求。

2.2.5 穩定性 配制5 種激素低、中、高濃度（0.1、2、80 ng·mL-1）的血清樣本，分別置于室溫24 h、4 ℃自動進樣盤放置24 h、反復凍融3 次、-70 ℃冷凍保存1 個月，每種處置方式每個濃度平行6 份，比較測定樣本的精密度和準確度。結果顯示，低、中、高濃度的精密度（RSD）和準確度（RE）均在±15%內，符合生物樣本測定要求。

表3 提取回收率和基質效應（n=6）

2.2.6 實際血清樣本分析 采用已建立的分析方法，對5 份血清樣本進行檢測，結果見表4。

表4 血清樣本的測定（ng·mL-1）

其中1、2 號樣本為2 名懷孕女性，年齡分別為29、31 歲；3～5 號樣本為3 名男性，年齡為24～36歲。由表4 可見，5 份血清樣本中均可檢測出不同濃度的T、AD、DHEA、P、17α-OHP，且存在明顯個體差異。以上表明，本方法適用于臨床血清樣本中關鍵雄激素和孕激素的同時測定。

3 討論

相比于免疫法，質譜法用于類固醇激素的測定具有很大優勢。自20 世紀70 年代以來，質譜法被逐漸運用到類固醇激素的測定中[6]。其中，氣相色譜-質譜聯用法在激素測定領域的發展比液相色譜-質譜聯用法更早[7]。研究證明，液相色譜-質譜聯用法具有更高的選擇性、靈敏度以及更加簡單的前處理過程。然而，由于類固醇激素的結構特性，其在質譜中的離子化效率很低，常采用衍生化技術對其結構中的羥基、羰基等基團進行衍生化處理，以提高其在質譜中的離子化效率。其中，酰化衍生化常用于雌激素的測定[8]。

本研究通過鹽酸羥胺肟化處理，極大增加了T、AD、DHEA、P、17α-OHP 在質譜中的離子化效率。該方法測定時間短（5 min），可同時定量5 種目標激素，且均為臨床檢測中用于腎上腺皮質增生、生殖功能障礙、高雄激素血癥等疾病的關鍵檢測品種，故本方法具有重要的臨床應用價值。

研究表明，包含雌激素、孕激素和雄激素的性激素代謝網絡是一個緊密關聯的整體，以膽固醇為前體，首先經側鏈縮短生成21 碳的孕激素，進一步去側鏈代謝為19 碳的雄激素，再通過A 環芳香化生成18 碳雌激素。在腎上腺皮質功能相關疾病的狀態下，孕激素和雄激素水平都顯示出很大的改變。高雄激素血癥被發現也可引起體內孕激素、雌激素水平的變化，同時引起不孕癥的發生。傳統的免疫檢測法，受商品化試劑盒的影響，不能夠全面、準確地了解不同個體性激素代謝的整體輪廓，故不能很好地提供個體化診療和用藥服務。

本研究采用了UPLC-MS/MS 法結合衍生化技術建立了可快速、同時檢測人血清中T、AD、DHEA、P 和17α-OHP 等5 種關鍵微量雄激素和孕激素的方法，結合本研究之前所建立的雌激素網絡質譜測定方法[9]，可對性激素代謝網絡的整體定量描繪提供精準的服務，在疾病診療、發病風險分析和激素補充治療的個體化策略制定中，具有一定的臨床應用價值。