高效液相色譜法測定人腦脊液中萬古霉素濃度及臨床應用*

黃曉會，林志燕，沈艷琳，卜書紅，張 健

上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092

顱內感染是重型顱腦外傷開顱術后嚴重并發癥，具有高致殘、致死率，會延長住院時間、增加治療費用，嚴重影響預后[1]。由于機體顱內血腦屏障的作用，使常規藥物較難透過、較難進入，因此降低了顱內感染的治療效果[2]。

萬古霉素（vancomycin，VAN）屬于三環糖肽類抗菌藥物，被譽為抗生素最后一道防線。臨床上是用于治療嚴重的顱內感染的常用藥，但其通過血腦屏障達到最小殺菌濃度的維持時間短，需要劑量大[2]，其具有一定的抗生素后效應時間依賴性，并且有耳、腎毒性和血栓性靜脈炎等嚴重不良反應。文獻報道，腦室內或鞘內注射抗菌藥物治療顱內感染具有較好的臨床療效[3]，此治療方法逐漸普及，但缺乏相關基礎研究，對藥物的安全劑量、用藥間隔時間、療程沒有統一的標準[4]，因此對監測腦脊液中藥物濃度至關重要。本研究采用內標法，建立腦脊液中的萬古霉素含量測定方法，對本院患者腦脊液濃度進行監測，可及時調整給藥方案，使其在安全有效濃度范圍內。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品及試劑

1260 高效液相色譜儀，包括G1367E 自動進樣器，G1311B 四元泵，G4212B 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；Milli-Q 純水器（Millipore）；VORTEX KB3 型旋渦混懸器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5424R 高速冷凍離心機（德國eppendorf 公司）。

萬古霉素對照品（批號：130329-200501）、去甲萬古霉素對照品（批號：130359-200503），均中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；高氯酸、磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純；純化水。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液 精密稱取萬古霉素對照品20 mg，用水定容至5 mL 量瓶中，配制成質量濃度為4000 mg·L-1的對照品儲備溶液，經水適當稀釋成對照品溶液。

1.2.2 磷酸二氫鉀緩沖液 精密稱取磷酸二氫鉀6.8045 g，用水溶解并定容至1000 mL，用磷酸調節pH 值至3.2，配制成0.05mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液。

1.2.3 內標溶液 精密稱取去甲萬古霉素對照品20 mg，用水定容至10 mL 的量瓶中，配制成質量濃度為2000mg·L-1的對照品儲備液，再取該溶液125μL至25 mL 量瓶中，加水定容至刻度，稀釋為10 mg·L-1的內標溶液，備用。

2 方法[5]與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：磷酸二氫鉀緩沖液（pH3.2）-乙腈（梯度洗脫：0～20 min：98%～90%A；20～25 min：90%～90%A；25～25.1 min：90%～98%A；25.1～30 min：98%A）；檢測波長：236nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.2 樣本前處理

精密取待測人腦脊液樣品180 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，加入內標溶液20 μL（100 mg·L-1），加入乙腈：6%高氯酸（1∶1，v/v）溶液200 μL，渦旋振蕩1 min，靜置10 min，13000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL 進樣分析。

2.3 專屬性考察

取使用萬古霉素的患者的人腦脊液樣本（見圖1A），再取空白腦脊液加入萬古霉素及去甲萬古霉素的對照品，經“2.2”項下樣本前處理，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果萬古霉素與去甲萬古霉素分離完全，其中內源性物質及流動相中的雜質對測定無干擾，色譜圖見圖1B。

圖1 萬古霉素腦脊液樣本（A）、萬古霉素與去甲萬古霉素加標腦脊液（B）色譜圖

2.4 標準曲線及定量下限

精密量取空白腦脊液900 μL，加入4000 mg·L-1的萬古霉素100 μL，配制成400 mg·L-1，依次用空白腦脊液稀釋成1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg·L-1的腦脊液標本，同時稀釋得低、中、高3種濃度的質控腦脊液標本，使其濃度分別為3.125、25、50 mg·L-1。經“2.2”項下樣本預處理，每個濃度平行3 份及空白樣本1 份，進樣測定標準曲線，以萬古霉素與去甲萬古霉素峰面積比值為縱坐標，樣本濃度（μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸。結果在1.5625～200 μg·mL-1濃度范圍內萬古霉素線性方程為：Y=8.41×10-2X+0.174，r=0.9990（n=3）。根據標準曲線，本方法的定量限為1.5625 μg·mL-1。

2.5 基質效應試驗[5]

經“2.2”項下樣本預處理的空白腦脊液，離心沉淀后用上清液分別配制成含萬古霉素濃度為3.125、25、50 mg·L-1基質溶液，每個濃度配制3 份，待進樣；另外，用水配制成相同含萬古霉素濃度為3.125、25、50 mg·L-1的溶液，每個濃度配制5 份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別比較3 個濃度的峰面積，空白腦脊液配制供試品比較水配制供試品，結果見表1。

2.6 準確度與精密度試驗

取空白腦脊液作為基質，配制萬古霉素低、中、高濃度為3.125、25.0、50.0mg·L-1的腦脊液樣本，每個濃度平行配制5 份，經“2.2”項下前處理，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別測定低、中、高3 個濃度水平的樣本各5 份，記錄峰面積。取配制好的萬古霉素對照品，依次稀釋成為3.125、25.0、50.0mg·L-1對照品，每個濃度平行配制5 份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，兩個峰面積比值計算絕對回收率，5 次進樣峰面積計算日內精密度（RSD）；每日按上述方法操作配制樣本，連續3 日，計算日間精密度。結果顯示，本方法測定腦脊液中萬古霉素的準確度均符合血藥濃度檢測條件；日內、日間精密度均＜6%。見表1。

表1 測定腦脊液中萬古霉素的準確度、精密度、基質效應（n=5）

2.7 穩定性試驗

取低、中、高濃度各5 個平行樣品，經“2.2”前處理后將上清液在室溫下分別放置4、24、48 h，進樣測定，計算變異系數（CV%）；將配制好的質控樣本置于4℃冰箱分裝保存，每隔1 周復測1 次，3 個水平分別測定5 組平行樣本，復測4 周，計算CV%。結果顯示，去甲萬古霉素和萬古霉素的樣本在上述試驗情況下穩定性良好，CV%均＜10%。

2.8 臨床應用

采用本方法為本院重癥顱內感染患者進行腦脊液中萬古霉素濃度監測，采樣為連續給藥4 劑后、用藥前0～30 min，采集谷濃度樣本；給藥結束后1～2 h 采集峰濃度樣本。其中測定峰濃度的患者共6例，谷濃度的患者共8 例，結果見表2。

表2 測定患者腦脊液中萬古霉素濃度結果

其中3 例患者腦脊液谷濃度低于10 μg·mL-1，4例患者谷濃度在10～20μg·mL-1，只有1 例大于20μg·mL-1，根據《桑福德抗微生物治療指南》[6]和美國傳染病學會[7]推薦：當治療顱內感染時，萬古霉素腦脊液谷濃度目標值范圍為10～20μg·mL-1，至少要保持在10μg·mL-1以上，以免發生耐藥。根據檢測結果，并結合患者實際情況，對藥物的用量做了適當調整。血藥濃度監測結果說明萬古霉素在患者中具有較大個體差異，對其進行腦脊液濃度監測非常重要。

3 討論

樣本處理方法的選擇直接影響HPLC 法的分離效果，萬古霉素與去甲萬古霉素樣本處理方法常用的有固相萃取法和直接沉淀法，其中直接沉淀法更為簡便、省時。考慮萬古霉素和去甲萬古霉素性質等各方面的因素，初步選擇乙腈、甲醇、6%高氯酸及乙腈：6%高氯酸（1∶1）作為沉淀提取劑、進行前處理優化，結果顯示，單從外觀方面，乙腈、甲醇、6%高氯酸沉淀反應較快；但使用乙腈、甲醇時回收率較低，6%高氯酸酸性較強，長時間使用致色譜柱柱效降低，縮短壽命；最終選擇用乙腈：6%高氯酸（1∶1）做為沉淀提取劑，其凈化反應較慢，需靜置10 min，充分反應后，離心凈化效果最佳，回收率高。

萬古霉素和去甲萬古霉素的最大吸收波長為220 nm，樣本中此吸收波長干擾峰較多，參考有關文獻，采用236 nm 作為檢測波長[1]。流動相先后采用了水-甲醇、水-乙腈、pH3.2 磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈進行試驗，在3 種流動相中，磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈分離的色譜峰型較好。又對磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈作梯度洗脫和等度洗脫的對比，結果顯示，梯度洗脫分離度更好，且萬古霉素與去甲萬古霉素隨著色譜柱柱效下降，兩個峰分離會明顯變差，而采用梯度洗脫色譜柱的壽命會延長，也可節約成本。本實驗所建方法準確可靠，簡單靈敏，檢測限為0.5μg·mL-1，可滿足臨床腦脊液中萬古霉素的藥動學研究要求。后續可通過本方法對院內患者進行萬古霉素腦脊液濃度測定，并收集病例進行分析，可對萬古霉素靜脈滴注聯合鞘內注射的臨床療效及安全性進行評估研究。