兒童腺病毒肺炎外周血單個核細胞中轉錄因子RORγt mRNA的表達意義

張倫敏，張 翔

(遵義市第一人民醫院/遵義醫科大學第三附屬醫院，貴州 遵義 563003)

人腺病毒(Human adenovirus，HADV)肺炎由腺病毒(ADV)感染所致,其臨床特點起病急、高熱持續時間長、中毒癥狀重[1].好發于6個月至5歲兒童，是較為嚴重的兒童社區獲得性肺炎[2]，臨床上大約有1/3 的腺病毒肺炎因各種原因轉變為重癥腺病毒肺炎[3]。重癥肺炎是小兒危重癥疾病之一，通常進展快，全身中毒癥狀重[4]。目前發病機制尚未完全清楚，但認為與病毒血清型、滴度以及宿主的免疫應答能力相關[5]，輔助性T細胞17(Th17)是一類主要分泌IL-17 A、IL-17F、IL-21、IL-22等細胞因子Th 細胞亞群，并通過這些細胞因子在機體的免疫反應中發揮重要的生物學功能，是最早參與抗感染免疫應答的效應性T細胞，同時在介導慢性炎癥、自身免疫病和腫瘤發病中也具有重要作用，孤獨核受體γt(Orphan nuclear receptor gammat，RORγt)是調控Th17細胞分化的特異性轉錄因子，很大程度上決定著Th17細胞的分化、發育，無論是體內Th17細胞介導的炎癥反應還是體外細胞因子誘導Th17細胞的分化都需要RORγt的參與。其表達水平的高低可以直接反映Th17細胞功能狀態。本研究擬檢測兒童腺病毒肺炎外周血單個核細胞(PBMCs)中Th17細胞特異性轉錄因子RORγt的表達水平，探討兒童腺病毒肺炎的免疫發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組全部來源于本院兒科住院患兒30例，其中男性患兒17例，女性患兒13例；年齡3個月至12歲，平均(5.2±2.0)歲。對照組30例為健康體檢兒童，其中男性兒童18例，女性兒童12例，年齡1～11歲，平均(6.2±3.1)歲。病例組與對照組在年齡、性別構成上差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)符合《兒童腺病毒肺炎診斷標準》[2]；(2)病原學檢測為腺病毒；(3)治療前個1月未使用影響免疫系統功能類藥物。排除標準：(1)患有其他自身免疫系統疾病；(2)合并有嚴重肝、心、腎疾病及惡性腫瘤疾病。

1.2 試劑和儀器 Trizol(Invitrogen公司)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技公司)，PCR儀器(Eppendorf公司)，核酸蛋白微量分析儀(Thermo公司)逆轉錄反應體系試劑盒、Real-TimePCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，DNA Marker( TaKaRa公司)，凝膠成像系統(BIO-RAD公司)，β-actin、RORγt引物均由寶生物工程(大連)工程有限公司合成(見表1)。

表1 檢測基因與對應的引物序列

1.3 方法 抽取空腹患兒及正常健康兒童外周血3 ml，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取外周血單個核細胞總RNA，取總RNA樣品2 μl放于核酸微量分析儀下測其RNA的濃度及OD260/OD280值(以DEPC水調零)進行純度鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。反轉錄條件為：37℃ 15 min；85℃ 5 s。Real-time PCR 反應條件：變性(95℃，3 min)；退火(95℃，5 s)；延伸(60℃，30 s)；循環(40 cycles)。各樣本相對表達量采用國際通用的相對定量法(2-ΔΔCT法)進行統計分析，以Ct值為統計參數依次計算下列數據：△△Ct=(Ct目的-Ct內參)病例組-(Ct目的-Ct內參)對照組，目的基因相對于某基因的表達量=2-ΔΔCT。

2 結果

RORγt mRNA部分標本QRT-PCR擴增產物電泳(見圖1)。β-actin、RORγt基因的Real time PCR擴增產物單一，熔解曲線未見雜峰，均為單一峰，擴增曲線拐點清楚，指數期明顯，排除了非特異性擴增和引物二聚體，擴增產物較好(見圖2～5)。

病例組外周血PBMCs中RORγt mRNA的表達水平為(5.30±3.95)，對照組為(1.11±0.50)，病例組明顯高于對照組，兩組比較差異有統計學意義(t=-5.75，P<0.001)。

3 討論

腺病毒屬于DNA病毒，分為A、B、C、D、E、F、G 7個亞群，90個血清型[6],主要在細胞核內繁殖，耐溫、耐酸、耐脂溶劑的能力較強。HADV-3、HADV-7型腺病毒在我國最常見，其中HADV-7型最容易發生重癥肺炎和死亡，目前該發病機制尚不完全清楚，但認為與病毒血清型、滴度以及宿主的免疫應答能力相關[7]。已有研究證實CD4+T細胞能識別腺病毒衣殼蛋白[8],具有免疫應答正性調節功能，其中Th1細胞主要分泌IFN-γ，IFN-α、IL-2等細胞因子增強抗感染能力，Th2細胞主要分泌IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子輔助B細胞活化參與機體體液免疫。兩者之間相互抑制增殖，由此說明Th1與Th2細胞比例的失衡可能參與到病毒感染的發生[9]，隨著分子免疫學研究的逐步深入，發現Th1/Th2平衡失調并不能完全闡明腺病毒肺炎的發病機制。

Th17 細胞是一類不同于Th1、Th2細胞的CD4+T 細胞另一亞群，其主要分泌IL-17A、IL-17F細胞因子，IL-17是最重要的效應因子，IL-17具有促進炎癥作用的細胞因子[10]，尤其在炎癥早期，能夠誘導促炎因子(如TNF、IL- 6)、趨化因子(如MPC1和MIP2)和基質金屬蛋白酶的表達，引起組織細胞的浸潤和組織破壞。除此之外，IL-17還參與中性粒細胞的增殖、成熟和趨化，對T細胞的活化起協同刺激作用[11]。RORγt作為Th17細胞的特異性轉錄因子，在Th17細胞的分化、發育中起重要作用，RORγt誘導Th17細胞的分化并調節IL-17的表達，若抑制RORγt 的表達，則能夠抑制未致敏T細胞向Th17細胞分化。

目前關于轉錄調節因子RORγt mRNA與兒童腺病毒肺炎發病關系的報道較少，本研究通過檢查兒童腺病毒肺炎外周血中Th17細胞中RORγt mRNA表達水平，探討RORγt mRNA在兒童腺病毒肺炎發病機制中的作用。實驗結果顯示對照組外周血中轉錄因子RORγt mRNA表達水平顯著高于對照組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.001)。表明兒童腺病毒肺炎Th17細胞在CD4+T輔助細胞中所占的比例上升，RORγt的高表達可能促進了Th17細胞分化，通過調節IL-17等致炎因子的分泌參與了兒童腺病毒肺炎的發生，提示Th17細胞及其特異性轉錄因子RORγt與兒童腺病毒肺炎發生發展密切相關，并在兒童腺病毒肺炎的免疫致病機制中發揮重要作用，但是RORγt在兒童腺病毒肺炎發病過程中更深層的作用及與其他轉錄因子表達影響還有待進一步研究。