新型冠狀病毒實驗室檢測專家共識

中國醫院協會臨床微生物實驗室專業委員會

1中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院檢驗科，北京 100730,E-mail:xycpumch@139.com 2國家老年醫學中心 中國醫學科學院老年醫學研究院 北京醫院國家衛生健康委臨床檢驗中心，北京 100730，E-mail:hujh68@126.com

2019年12月，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫情暴發，并在全球范圍內大流行。雖然我國對COVID-19疫情的防控取得了階段性勝利，但全球疫情仍極為嚴峻。當前我國疫情防控的重點，已從對本土病例的防控轉變為對境外輸入性病例的防控，以及對經冷鏈運輸進口物品攜帶污染及密切接觸人群的監測。各臨床醫療機構和疾病預防控制部門的SARS-CoV-2檢測工作已呈常態化，應大力提升并具備隨時應對新一波疫情暴發、流行的能力。基于目前臨床檢測SARS-CoV-2所積累的經驗和常見問題，并結合最新研究進展，中國醫院協會臨床微生物實驗室專業委員會組織我國臨床微生物學、分子生物學和免疫學檢驗相關領域專家共同撰寫了《新型冠狀病毒實驗室檢測專家共識》。本共識明確了目前SARS-CoV-2臨床常用檢測方法的技術特點、注意事項、生物安全要求、檢測和結果解讀的常見問題及應對策略，以期在疫情防控常態化形勢下，為臨床實驗室正確、高效開展SARS-CoV-2檢測提供參考意見。

1 共識形成方法

本共識由中國醫院協會臨床微生物實驗室專業委員會發起，共識專家組由該委員會委員及其推薦的相關領域專家共同組成，并通過共識形成會議法[1]達成共識意見。專家組擬訂關鍵問題和共識提綱后，以“新型冠狀病毒”“新型冠狀病毒肺炎”“severe acute respiratory syndrome coronavirus 2”“SARS-CoV-2”“coronavirus disease 2019”和“COVID-19”為關鍵詞，檢索2019年12月至2020年11月期間PubMed、EMBase、Cochrane Library、中國知網、萬方數據、維普網數據庫中關于SARS-CoV-2和COVID-19實驗室檢測相關的中、英文文獻，以及國家衛生健康委員會和世界衛生組織發布的COVID-19診療方案和技術標準，國內外學術組織現行的感染控制、生物安全相關標準、指南和共識等。經3輪遠程會議討論及反復修訂，形成共識草案，然后由所有專家對草案進行函審并提出書面意見，共收集函審意見539條(含重復意見)，全部意見在第4次會議上逐條進行討論確認，并采納其中的458條，經23次修訂最終形成本共識終稿。鑒于目前對SARS-CoV-2的認知程度及共識參與人員的專業背景，本共識的制定可能存在一定局限性。

2 新型冠狀病毒核酸檢測

2.1 核酸檢測方法

國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》[2]指出，對疑似病例采用實時熒光PCR法檢測SARS-CoV-2核酸為陽性或病毒基因測序結果與已知的SARS-CoV-2序列高度同源，即可確診為SARS-CoV-2感染。核酸檢測陽性是發現SARS-CoV-2攜帶者(SARS-CoV-2核酸陽性但無明顯臨床和影像學表現，且血清特異性SARS-CoV-2抗體陰性者)和確診SARS-CoV-2感染的金標準。

在SARS-CoV-2基因組序列確定的情況下[3-5]，靶標可針對病毒基因組保守區域進行設計。SARS-CoV-2核酸檢測的靶基因主要包括：開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核殼蛋白(nucleocapsid protein，N)、包膜蛋白(envelop protein，E)和刺突糖蛋白編碼(spike glycoprotein，S)基因[6]。目前在中國獲批的試劑盒主要是針對其中的一個或多個靶標進行檢測，建議同時檢測2個及以上靶標，以保證結果的特異度和準確性。

目前國家藥品監督管理局(National Medical Pro-ducts Administration，NMPA)批準上市的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒所采用的檢測方法主要有實時熒光PCR法、恒溫擴增法、聯合探針錨定聚合測序法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA 捕獲探針法、RNA 恒溫擴增捕獲—金探針層析法、雙擴增法以及基于下一代測序技術(next-genera-tion sequencing,NGS)的SARS-CoV-2核酸檢測方法等。

2.1.1 實時熒光PCR法

目前醫療機構臨床實驗室開展SARS-CoV-2核酸檢測所采用的方法以實時熒光PCR法為主，其檢測下限為102～103copies/mL，部分產品可達10 copies/mL。該方法檢測耗時存在差異，通常兩步法(即核酸提取與PCR擴增步驟獨立進行)約需3～3.5 h(包括核酸提取0.5～1.5 h，PCR擴增1.5～2 h)，一步法(即核酸提取與PCR擴增一體化)可縮短至1 h以內。

2.1.2 恒溫擴增法

恒溫擴增法是在固定的溫度條件下進行擴增，包含恒溫擴增實時熒光法和恒溫擴增芯片法。恒溫擴增實時熒光法是將恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合，可將SARS-CoV-2核酸檢測全流程時間縮短至1.5 h以內。恒溫擴增芯片法是將恒溫擴增技術與微流控芯片技術相結合，其特點是可在同一份樣本中同時檢測多種病原體。恒溫擴增法具有集成能力強、自動化程度高、檢測時間短、檢測下限低(可達102copies/mL)等特點。

2.1.3 其他PCR方法

聯合探針錨定聚合測序法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA捕獲探針法、RNA恒溫擴增捕獲—金探針層析法、雙擴增法和巢式多重PCR法在SARS-CoV-2核酸檢測中亦發揮了重要作用。在擴增多重病原靶標時，需同時檢測1～2種室內質控，以確保樣本處理、核酸提取及PCR反應的有效性。此外，也有研究使用PCR-核酸飛行時間質譜進行SARS-CoV-2核酸檢測[7]；或應用質譜技術直接使用臨床樣本從多組學角度檢測SARS-CoV-2[8-10]。

SARS-CoV-2核酸檢測的方法較多且各具特點，即使同一種檢測方法，由于檢測試劑生產廠家或檢測儀器不同，所需檢測時間及檢測下限均可能存在差異。因此，在實際工作中實驗室應根據所使用的檢測試劑及設備說明書，制定相應的標準操作規程，開展SARS-CoV-2核酸檢測工作。

2.1.4 基于NGS的SARS-CoV-2核酸檢測

NGS不依賴傳統的微生物培養，具有高通量、一次可檢測多個靶基因的特點，可發現新發病原體、監測病原體變異，為診斷試劑、疫苗、藥物等研發和應用提供依據。在此次疫情初期，利用NGS從臨床樣本中成功鑒定出了SARS-CoV-2的基因組序列[11]，為SARS-CoV-2的早期發現和診斷提供了重要依據。疫情期間，NMPA應急批準SARS-CoV-2測序試劑盒可用于臨床樣本的常規檢測。但目前NGS主要用于科研，其臨床大規模應用需進一步標準化和規范化。

2.2 核酸檢測注意事項與生物安全要求

SARS-CoV-2核酸檢測主要包括樣本采集、轉運和接收、核酸提取、PCR擴增、報告解讀及醫療垃圾處理等步驟。其注意事項及生物安全要求見表1。

表1 新型冠狀病毒核酸檢測常見注意事項及生物安全要求

2.3 核酸檢測結果解讀存在的問題與對策

2.3.1 核酸檢測與復檢

以下情況建議復檢：(1)樣本經PCR擴增后，目的基因Ct值大于試劑說明書閾值，但原始峰圖有信號；(2)擴增結果為陽性，但原始峰圖并非典型的“S”形曲線；(3)雙靶標試劑檢測結果不一致；(4)雙份試劑檢測結果不一致；(5)檢測結果與臨床癥狀、影像學表現不一致；(6)若不同病程階段核酸檢測結果發生變化，需連續多次采樣；(7)大規模人群篩查流行率極低(<0.1%)時，出現陽性結果，應使用1～2種更靈敏且擴增區域不同的試劑復檢[12]。

2.3.2 流行病學結合臨床分析原則

雖然核酸檢測是SARS-CoV-2病原學診斷的金標準，但仍存在一定的局限性。當臨床高度懷疑SARS-CoV-2感染而核酸檢測陰性時，需結合患者肺部CT、SARS-CoV-2特異性抗體、血常規等其他檢測結果進行綜合判斷。

2.4 核酸檢測結果假陰性、假陽性分析

2.4.1 假陰性結果主要原因：(1)感染的不同時期，病毒在人體不同部位載量存在差異；(2)樣本采集不規范；(3)樣本轉運、保存或滅活方法不當，導致RNA降解；(4)病毒基因序列發生變異。

2.4.2 假陽性結果多由實驗室污染或操作不當造成。

2.4.3 避免假陰性或假陽性結果的應對策略

(1)試劑質量控制：對不同的SARS-CoV-2核酸檢測試劑性能進行比較，對試劑的性能參數進行驗證，選取各種性能均較好的試劑。

(2)操作質量控制：核酸檢測的整個流程操作復雜，不同產品的反應體系及適用機型等存在差異，實驗人員應嚴格按照各自產品說明書要求進行操作。實驗室應對樣本采集、轉運與保存、核酸提取、PCR擴增、結果審核及報告進行全流程質量控制。

(3)設置對照：除每個檢測批次至少設置3份陰性對照、1份弱陽性對照(第三方質控品)[12]和內標控制孔外，應設置空白對照以監測實驗室污染。

(4)多指標診斷：對核酸檢測結果為陰性但臨床疑似感染患者，應進行多部位樣本、多次采樣檢測，并結合血清學結果、影像學表現等進行綜合判斷。

3 新型冠狀病毒免疫學檢測

N蛋白和S蛋白是免疫檢測的主要抗原靶點。N蛋白位于病毒顆粒包膜內核，與正義單鏈RNA纏繞并將其封裝成RNA核衣殼體；S蛋白分布于病毒外殼，冷凍電鏡超微結構為三聚體，其受體結合結構域(receptor binding domain,RBD)與人體細胞血管緊張素轉換酶2受體結合后入侵人體細胞并導致感染[25]。

3.1 新型冠狀病毒特異性抗體檢測

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[26]首次將“血清SARS-CoV-2特異性抗體IgM和IgG陽性；血清SARS-CoV-2特異性抗體IgG由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高”作為疑似病例的確診標準之一?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第八版)》[2]將“SARS-CoV-2特異性抗體IgM陽性”作為疑似病例診斷依據之一，并指出“SARS-CoV-2特異性抗體IgM和IgG在發病1周內陽性率較低，一般不單獨以血清學檢測作為診斷依據，需結合流行病學史、臨床表現和基礎疾病等情況進行綜合判斷”，強調動態觀察抗體水平變化。因此，核酸檢測仍是判斷SARS-CoV-2感染的金標準[27]，抗體檢測可用于核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測，或在疑似病例診斷中與核酸檢測聯合應用，但不能代替核酸檢測單獨作為SARS-CoV-2感染者確診與否的依據，亦不適用于一般人群的篩查。隨著SARS-CoV-2疫苗接種人群的逐漸擴大，詳細詢問患者疫苗接種史及免疫相關基礎疾病，對理解其抗體水平變化趨勢及抗體檢測結果至關重要。

3.1.1 抗體檢測方法

SARS-CoV-2抗體檢測試劑多以N蛋白和S蛋白作為捕獲抗原，主要檢測IgM、IgG。一般情況下，機體感染病毒后抗體水平變化如圖1。IgM產生最早(SARS-CoV-2特異性抗體IgM多在發病3～5 d后開始出現陽性[2,28])，但濃度及親和力較低、維持時間短，是急性期感染的診斷指標；IgG產生較晚(一般在出現癥狀一周后[28-29])，但濃度及親和力高、維持時間較長(有研究顯示SARS-CoV-2特異性抗體IgG維持時間約為3～6個月)，是感染中后期或既往感染的診斷指標[30]。機體感染SARS-CoV-2產生抗體的時間和規律仍需更多的科學研究加以證實。

圖1 新型冠狀病毒檢測項目在不同感染病程中的應用示意圖

NMPA已批準的SARS-CoV-2抗體檢測方法主要有化學發光法、膠體金法和熒光免疫層析法?；瘜W發光法具有線性范圍寬、通量高、自動化程度高、操作易于標準化等特點，但依賴于特定的化學發光檢測儀，成本較高，臨床普及受限。膠體金法和熒光免疫層析法操作簡便、快捷，突破了現有檢測技術對人員、場所的限制，可在15 min內獲得結果，適用于基層醫療單位及現場篩查，但靈敏度受限[31]。上述方法均為定性檢測，目前尚無可用于定量分析的試劑盒。

3.1.2 抗體檢測注意事項與生物安全要求

SARS-CoV-2抗體檢測的注意事項及生物安全要求見表2。

表2 新型冠狀病毒抗體檢測常見注意事項及生物安全要求

3.1.3 抗體檢測結果解讀中的問題與對策

3.1.3.1 抗體檢測與復檢

(1)在低流行風險人群中，若抗體檢測結果呈弱陽性或陽性，建議結合核酸檢測等結果進行解讀，亦可采用另一種高特異度的方法或試劑盒進行復檢；

(2)如抗體檢測結果呈陰性，但臨床懷疑為SARS-CoV-2感染，建議進行核酸檢測，并采用另一種高靈敏度的方法或試劑盒進行復檢；

(3)如考慮存在干擾因素，可通過樣本滅活、使用類風濕因子吸附劑處理等方式處理后，進行復檢。

3.1.3.2 不同檢測方法間性能存在差異的原因

(1)原理不同：雙抗原夾心法、捕獲法、間接法等不同檢測方法的靈敏度不同。

(2)捕獲抗原不同：①抗原種類或選擇的片段不同：N蛋白的免疫原性和特異度均高于S蛋白，但靈敏度低[37]，不同試劑盒可能單獨采用S蛋白、N蛋白或S+N蛋白抗原組合、全長或僅RBD為捕獲抗原；②S∶N抗原比不同；③體外重組蛋白表達系統不同，真核表達系統表達的蛋白具有一定程度的折疊加工和糖基化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白更穩定，特異度更高。

(3)待檢抗體種類不同：如單獨檢測(IgM或IgG)、雙重檢測(IgM+IgG)或總抗體檢測(IgM+IgG+IgA)，聯合檢測可提高檢出率。

3.1.3.3 抗體檢測結果假陰性、假陽性分析

假陰性檢測結果的可能原因：(1)抗體表達存在窗口期；(2)檢測試劑盒靈敏度受限；(3)樣本保存或實驗操作不當；(4)輕癥患者抗體反應較弱[38]；(5)樣本滅活導致低水平抗體降解。

假陽性檢測結果的可能原因：(1)不同種屬冠狀病毒的N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應[39]；(2)患者自身存在高濃度類風濕因子、抗核抗體等免疫學干擾因素[40-41]；(3)實驗室或試劑盒污染；(4)樣本檢測前的滅活可能導致熒光免疫層析法檢測假陽性[42]；(5)陽性判斷值的設定：陽性判斷值附近的弱陽性，有一部分可能為假陽性，因此弱陽性患者建議3～5 d后復查；(6)樣本溶血、血液樣本凝固不全或患者出現黃疸等，可能會導致假陽性結果，但目前缺乏實驗證據，需進一步研究驗證。

3.2 新型冠狀病毒核酸和特異性抗體聯合檢測結果解讀

核酸檢測結果是判斷患者有無SARS-CoV-2感染的直接證據，抗體檢測結果可作為輔助判斷SARS-CoV-2感染的間接證據以及評估疫苗效果，核酸檢測與抗體檢測各有優劣，不能互相替代。單獨采用抗體檢測時，其結果解讀需謹慎，尤其應核對患者流行病學史、是否接種SARS-CoV-2疫苗及是否合并免疫相關基礎疾病。人體感染SARS-CoV-2后核酸載量、抗體水平呈現不同的變化(圖1)，在不同病程階段，核酸和抗體檢測的靈敏度不同，特別是在感染中后期，核酸檢出率降低，抗體檢出率升高，核酸與抗體聯合檢測可降低漏診率，提高檢出率，對臨床診斷具有重要意義。針對實驗室SARS-CoV-2核酸及抗體聯合檢測結果的解讀見表3。

表3 新型冠狀病毒核酸及抗體聯合檢測結果解讀[31]

3.3 新型冠狀病毒抗原檢測

抗原檢測是指應用SARS-CoV-2特異性抗體直接檢測樣本中的病原體，其結果可作為早期確認該病原體感染與否的直接證據，且具有操作簡便、報告時間短等優勢。所檢測抗原主要是N蛋白和S蛋白，N蛋白在β屬冠狀病毒之間相對保守、合成數量多，具有很強的抗原性，其抗原決定簇是特異性抗體結合的主要位點?？乖瓩z測適用的樣本類型一般為感染部位樣本，主要為鼻咽拭子和肺泡灌洗液等。檢測結果受樣本質量、感染部位及病毒表達量等因素影響較大，靈敏度低、易產生假陰性結果。如何提高抗原檢測的靈敏度是影響該檢測方法在臨床上應用的關鍵問題，需進一步篩選制備高親和力和高特異度的抗體，以用于抗原檢測試劑的開發。

目前，國內外許多企業致力于SARS-CoV-2抗原檢測試劑盒的研發，已有試劑盒獲得食品藥品監督管理局緊急使用授權并批準上市，NMPA亦應急審批通過2款SARS-CoV-2抗原檢測試劑盒上市。

4 新型冠狀病毒培養

細胞培養分離病毒是病原學鑒定的金標準，所獲毒株是檢測試劑和疫苗開發、抗病毒藥物篩選等研究的重要基礎。SARS-CoV-2的培養必須在具備生物安全三級(BSL-3)及以上資質的實驗室內進行，不得在臨床常規生物安全二級(BSL-2)實驗室中進行，因此不推薦新型冠狀病毒培養作為常規診斷方法。鼻咽拭子、痰及其他下呼吸道分泌物等臨床樣本均可通過接種人呼吸道上皮細胞、Vero-E6和Huh-7細胞系等進行分離培養。選取經熒光定量PCR和/或NGS方法檢測出核酸陽性且Ct值較低(即病毒載量較高)的樣本進行分離培養，應考慮取材部位、取材時間及樣本送檢與保存等因素的影響。

5 小結

SARS-CoV-2是一種新發病原體，目前對該病毒的致病性、檢測方法性能的了解仍有限，需開展更多的基礎和臨床研究，以提高其檢測方法效能、提升臨床及實驗室診斷能力。本共識基于現有研究結果和相關指南，對SARS-CoV-2實驗室檢測相關問題進行了分析，并提出了應對策略，以供臨床實驗室參考和應用。在SARS-CoV-2檢測過程中，臨床實驗室應積極與臨床溝通，結合患者流行病學史、臨床表現、影像學改變及其他檢測結果綜合分析。對于未來可能發生甚至目前已經發生的病毒生物學變異所帶來的檢測挑戰，仍有諸多未知因素有待進一步探索和研究。

本共識專家組成員(按貢獻度排序)：

王瑤(北京協和醫院)，李軍(解放軍總醫院第一醫學中心)，寧雅婷(北京協和醫院)，羅燕萍(解放軍總醫院第一醫學中心)，周澤奇[丹娜(天津)生物科技有限公司]，林勇平(廣州醫科大學附屬第一醫院)，徐英春(北京協和醫院)，胡繼紅(國家老年醫學中心 中國醫學科學院老年醫學研究院 北京醫院國家衛生健康委臨床檢驗中心)，李永哲(北京協和醫院)，馬筱玲(中國科學技術大學附屬第一醫院)，邵育曉(北京貝爾生物工程股份有限公司)，張戈(北京協和醫院)，盧國萍[梅里埃診斷產品(上海)有限公司]，季煦(武漢大學健康學院)，劉勇(中國醫科大學附屬盛京醫院)，喻華(四川省醫學科學院 四川省人民醫院)，張櫻(解放軍總醫院第一醫學中心)，柯江維(江西省兒童醫院)，李俊明(南昌大學第一附屬醫院)，胡云建(北京醫院)，單斌(昆明醫科大學第一附屬醫院)，吳潔(北京協和醫院)，劉文恩(中南大學湘雅醫院)，楊濱(福建醫科大學附屬第一醫院)，阿祥仁(青海省人民醫院)，郭鷹(陸軍軍醫大學第一附屬醫院)，褚云卓(中國醫科大學附屬第一醫院)，朱鐳(山西省兒童醫院 山西省婦幼保健院)，張利俠(陜西省人民醫院)，康梅(四川大學華西醫院)，李彬(福建醫科大學附屬協和醫院)，劉小平(北京大學深圳醫院)，顧兵(徐州醫科大學附屬醫院)，佘丹陽(解放軍總醫院)，徐雪松(吉林大學中日聯誼醫院)，胡龍華(南昌大學第二附屬醫院)，胡辛蘭(福建省立醫院)，賈偉(寧夏醫科大學總醫院)，李六億(北京大學第一醫院)，魏蓮花(甘肅省人民醫院)，張義(山東大學齊魯醫院)，周俊(圣湘生物科技股份有限公司)

執筆人(按貢獻度排序)：

王瑤(北京協和醫院)，李軍(解放軍總醫院第一醫學中心)，寧雅婷(北京協和醫院)，羅燕萍(解放軍總醫院第一醫學中心)，周澤奇[丹娜(天津)生物科技有限公司]，林勇平(廣州醫科大學附屬第一醫院)，徐英春(北京協和醫院)

利益沖突：丹娜(天津)生物科技有限公司、北京貝爾生物工程股份有限公司和圣湘生物科技股份有限公司在本共識撰寫過程中提供了技術支持