周圍神經損傷病理進程中巨噬細胞作用研究進展

雪若妍 楊華

中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院耳鼻咽喉頭頸外科（北京 100730）

華勒氏變性（Wallerian degeneration）是周圍神經（peripheral nerve,PN）受到損傷或發生炎癥后，軸突出現崩解、碎裂的過程,同時也是周圍神經損傷后近端軸突再生的必要條件。華勒氏變性過程中，先天性免疫細胞（中性粒細胞，巨噬細胞和樹突細胞）和獲得性免疫細胞（T細胞和B細胞）均在病理部位聚集，并引起雪旺氏細胞去分化（de-differentiation）和軸突再生。目前認為，PN損傷后巨噬細胞發揮非常重要的作用[1]。

面神經（facial nerve,FN）雖然是顱神經仍然屬于PN，FN損傷后的修復研究多借鑒坐骨神經和臂叢神經損傷。目前，FN損傷中巨噬細胞發揮作用的報道較少。本文初步總結和分析PN損傷后，巨噬細胞所發揮作用的報道，為研究FN損傷的修復提供參考。

1 巨噬細胞的兩種存在形式：固有巨噬細胞和浸潤巨噬細胞

目前認為周圍神經系統存在兩種巨噬細胞。一種是起源于卵黃囊和胚胎肝組織，稱為組織固有巨噬細胞（tissue-resident macrophage），終生靜息存留在健康組織內，在組織發生病損時發揮作用。另一種是浸潤巨噬細胞（infiltrating macrophage），來源于骨髓，在組織病變時浸入組織。中樞神經系統的固有巨噬細胞被稱為小膠質細胞，來源于卵黃囊。但是，腸道的固有巨噬細胞起源于骨髓[2]，周圍神經的固有巨噬細胞部分來源于骨髓。在坐骨神經中，固有巨噬細胞約占細胞總數6%；在人類感覺和交感神經節中固有巨噬細胞比例為20%[2]。浸潤型巨噬細胞來源于骨髓的單核細胞，組織損傷或感染以后進入組織。坐骨神經切斷后，浸潤和固有型巨噬細胞的比例為3：1[2]。

在PN損傷或感染后，固有和浸潤的巨噬細胞具有不同的功能。Mueller等觀察到在坐骨神經擠壓后兩天內，固有巨噬細胞開始吞噬髓鞘；雪旺氏細胞因此去分化，這在浸潤巨噬細胞流入之前發生。他們還在這個早期時間點觀察到了固有巨噬細胞的增殖。目前認為，雖然固有巨噬細胞、中性粒細胞和雪旺氏細胞是神經損傷后的第一應答者，但是，巨噬細胞和去分化的雪旺氏細胞可以釋放大量的促神經軸突再生因子[3]。

2 巨噬細胞極化（兩種功能狀態）

巨噬細胞被分為兩種表型：促炎性巨噬細胞（M1）和抗炎巨噬細胞（M2）。M1和M2巨噬細胞分別代表巨噬細胞活化的兩種極端狀態。M1巨噬細胞介導宿主防御并分泌促炎細胞因子和分子以引起組織損傷和疾病發展，而M2巨噬細胞表達高水平的抗炎分子以減少炎癥并促進疾病恢復。從靜息狀態到M1狀態的巨噬細胞的活化通常由微生物產物和促炎細胞因子和分子誘導，如圖1[4,5]、表1[6]。

圖1 A巨噬細胞表型轉化以及功能示意圖。巨噬細胞經脂多糖和干擾素γ可極化為M1表型，經IL-4和IL-13轉化為M2表型。這兩個亞型之間可相互轉化。M1巨噬細胞表達一氧化氮合酶（iNOS），分泌腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6、活性氧（ROS）、白細胞介素-1β、一氧化氮和基質金屬蛋白酶（MMPs）。M2巨噬細胞表達精氨酸酶，分泌IL-10、轉化生長因子-β和細胞外基質分子（ECM）。B M1(粉紅色)和M2(藍色)樣巨噬細胞在軸突切斷的神經元胞體和遠端神經節上的確切功能尚無定論。Fig.1 A.Diagram showing the polarization of macrophages in vitro by LPS and IFN-γ to an M1-like phenotype and by IL-4 and IL-13 to an M2-like phenotype.The color spectrum between the two subtypes indicates the spectrum of macrophage phenotypes that are thought to exist in vivo.M1 macrophages express nitric oxide synthase(iNOS)and secrete TNFα,IL-6,reactive oxygen species(ROS),IL-1β,NO(nitric oxide),and matrix metalloproteinases(MMPs).M2 macrophages express arginase and secrete IL-10,TGF-β,and extracellular matrix molecules(ECM).B.Questions remain as to the exact function of M1(pink)-and M2(blue)-like macrophages on the axotomized neuronal cell bodies and the distal nerve segment.

表1 巨噬細胞極化為M1（促進炎癥反應）和M2（抗炎癥反應）期的表型Table 1 Macrophages polarize into M1(proinflammatory)and M2(anti-inflammatory)phenotypes

3 周圍神經損傷后，巨噬細胞在損傷遠端、近端以及神經節周圍聚集

目前，對軸突切斷后周圍神經中巨噬細胞的研究幾乎完全集中在神經損傷遠端[4]（圖2）。坐骨神經損傷后3天，巨噬細胞在損傷遠端聚集，14天達到峰值，56天仍未完全消失。損傷后3天，巨噬細胞在神經外膜的聚集多于內膜，而在14天正好相反[7]。但是，這些聚集的巨噬細胞的清除方式尚無明確定論。已有文獻報道認為是由于巨噬細胞的調亡，或是淋巴結和脾臟的淋巴細胞清除發揮了作用[8]。另外，在損傷的坐骨神經近端，巨噬細胞亦有少量的聚集。

圖2 周圍神經軸突切斷或擠壓后神經元的示意圖。圖中顯示了巨噬細胞聚集的兩個部位。圖的下部顯示了遠端軸突的變性，雪旺氏細胞的轉分化并分泌趨化因子CCL2，吸引巨噬細胞至遠端變性段。這是軸突切斷后巨噬細胞聚集的經典觀點。圖的上部顯示巨噬細胞也聚集在切斷軸突的神經元胞體周圍，這些神經元本身在切斷軸突后分泌趨化因子CCL2。Fig.2 A diagram of a hypothetical peripheral neuron following axonal transection or crush showing the two sites of macrophage accumulation.The lower part of the figure shows the degeneration of the distal axonal segment,the trans-differentiation of Schwann cells,the secretion by the Schwann cells of the chemokine CCL2,and the attraction of macrophages to the distal degenerating segment.This is the classical view of macrophage accumulation after axotomy.The upper part of the figure shows that macrophages also accumulate around the axotomized neuronal cell body and these neurons themselves secrete the chemokine CCL2 following axotomy.

軸突切斷后巨噬細胞聚集的另一位點為神經元胞體（圖2）。坐骨神經切斷后，巨噬細胞聚集在腰椎背根神經節（dorsal root ganglion，DRG），損傷后4天出現，32天時還可以見到。巨噬細胞也在頸上神經節（superior cervical ganglion，SCG）聚集，損傷后的2天出現，8-14天保持峰值[9]。

FN的神經元胞體位于腦干，該神經損傷后，小膠質細胞（中樞神經系統中的巨噬細胞）將聚集在損傷神經胞體周圍[10,11]。

4 巨噬細胞的趨化因子

趨化因子（或趨化細胞因子）是將白細胞吸引至損傷或感染組織的小肽分子。趨化因子作用于白細胞表面的G蛋白偶聯受體。CCL2是單核細胞的主要趨化因子，并且其與受體CCR2的親和力最高。CCR2由單核細胞和巨噬細胞表達；然而，它同時也在損傷后的感覺神經元與衛星膠質細胞中表達。在Ccl2-/-或Ccr2-/-動物中，神經損傷后遠端坐骨神經和DRG中發生巨噬細胞積聚減少[12]。若注射抗體，消耗CCL2后，可抑制遠端坐骨神經中的巨噬細胞積聚并抑制髓鞘的清除。Lindborg等通過注射CCR2的抗體（即MC-21）發現相同的結論，證實CCL2與CCR2結合后趨化巨噬細胞[12]。

在軸突切斷術后Ccl2 mRNA在損傷遠端12小時內表達，并在1-3天之間達到峰值[13]。

但是，在大多數研究中，在假手術大鼠或小鼠脊髓背根神經節中檢測到非常低量的Ccl2 mRNA和蛋白質[14]。目前還不清楚如何解釋正常神經節表達Ccl2 mRNA和蛋白質的意義。

5 巨噬細胞在華勒氏變性中的作用

華勒氏變性是周圍神經損傷后近端軸突再生的必然和必要過程，沒有適當的華勒氏變性就不可能有滿意的軸突再生。華勒氏變性包括遠端軸突變性、髓鞘分解、神經膠質細胞增殖、血-神經屏障（BNB）損害以及巨噬細胞的浸潤和活化[15]。在坐骨神經損傷后早期，浸潤巨噬細胞流入之前，固有巨噬細胞增加并激活，處于增殖狀態并參與華勒氏變性。固有巨噬細胞能夠通過Toll樣受體（TLRs）的表達和產生IL-13和IL-1β誘導炎癥過程[16]。這些變化在坐骨神經損傷后第3天和第4天更明顯，并且在坐骨神經損傷后28天仍可識別ED1陽性的固有巨噬細胞[2]。更重要的是，這些固有巨噬細胞參與了坐骨神經損傷后的早期髓鞘吞噬作用[2]。

在華勒氏變性后期，巨噬細胞是導致去除髓鞘和軸突碎片的關鍵細胞。已經證明，在華勒氏變性過程中，可以看到浸潤巨噬細胞中含有髓鞘來源的脂類分子[17]。在小鼠周圍神經損傷后，用二氧化硅阻斷單核細胞后，可導致巨噬細胞浸潤的減少以及髓鞘降解速度的減慢。進一步的研究表明，使用不同的藥理學和遺傳學方法，在巨噬細胞耗盡的動物中華勒氏變性的發生變延遲[17]。活細胞成像研究還表明巨噬細胞在軸突斷裂之前很久就到達損傷部位[18]。總之，這些發現支持巨噬細胞在華勒氏變性中起關鍵作用。

6 巨噬細胞在周圍神經再生過程中的作用

雖然巨噬細胞最初因其有效的吞噬活性而受到重視，但越來越多的研究證明巨噬細胞在周圍神經再生中也發揮著關鍵作用。Barrette等[17]發現通過抑制巨噬細胞，如向坐骨神經損傷局部連續遞送更昔洛韋或在CD11b-TKmt-30小鼠中全身給予更昔洛韋后，會損害軸突再生和運動功能的恢復。表明靶向誘導巨噬細胞、促進周圍神經損傷修復和功能恢復的潛在可能性。

巨噬細胞產生多種因子，如蛋白酶和生長促進因子/細胞因子，以及刺激細胞外基質(extracellular matrix,ECM)重塑以促進周圍神經再生。雪旺氏細胞通過不同的機制在周圍神經再生中發揮著重要作用[19]，值得注意的是通過調節受損神經中雪旺氏細胞的活性可以對巨噬細胞的功能進行調節，包括有絲分裂和去分化，以及滲透和/或遷移[20]。更重要的是，巨噬細胞也影響雪旺氏細胞的功能。坐骨神經切斷后，損傷部位的缺氧狀態被巨噬細胞特異性地感知后，巨噬細胞可分泌VEGF-A誘導血管分化，幫助雪旺氏細胞遷移并跨越斷端（橋接作用），誘導神經再生[21]。除了損傷后進入遠端神經外，巨噬細胞也在軸突切斷的細胞體周圍積聚，在那里它們直接刺激神經再生[22]。

7 面神經損傷的研究意義

面部表情在社會交往行為中發揮重要作用。FN損傷可導致面部活動不對稱、表情缺失、口干、眼干等，嚴重影響人類的社會生存能力[23]。新生兒FN損傷的發生率為0.6-1.8/1000，通常與產傷有關。成人FN損傷的發生率為每10萬人口17-35例[24]。成人FN損傷病因主要包括：特發性疾病（貝爾麻痹）、感染性疾病（Hunt綜合征、中耳炎、膽脂瘤等）、顳骨損傷。因此，進一步深入研究FN損傷后保護與再生機制具有重要的臨床意義。

85%的FN損傷患者在損傷后的3-4周內可不完全恢復，損傷后的6個月內可以完全恢復。93-98%的不完全損傷可以獲得完全恢復。在完全損傷中：年齡大于60歲、損傷3周后幾乎沒有恢復、妊娠過程中的損傷、神經電生理（損傷3天之后，3周之內檢查）顯示神經退變、合并糖尿病等系統疾病患者的預后較差[25]。目前在臨床上，FN損傷的治療可分為非手術方法以及手術方法兩大類。前者雖缺乏真正的神經肌肉修復，但仍是改善面部靜態外觀的重要輔助手段。手術方式主要包括FN吻合、FN減壓及自體神經移植等[26]。由于其周圍神經受到局部和整體的影響，FN損傷后再生困難。雖然目前外科手術取得顯著進步，但由于自體神經移植的本質上是用自身的正常神經修復損傷神經，存在供體不足的局限性，同時還會造成供區功能的喪失。因此，FN損傷的治療仍然是耳鼻喉科的臨床難題。

大部分不完全性周圍神經損傷可以治愈，但是完全性周圍神經損傷后的修復仍然是臨床難題。由于周圍神經損傷在肢體和椎旁部位更加常見，因此對于周圍神經感覺和運動損傷的研究多使用頸椎脊髓的背根神經節以及坐骨神經的動物模型，尤其是小鼠動物模型。

FN屬于周圍神經，損傷后嚴重影響患者的生存質量，是耳鼻喉科的臨床難題。無論是機械性，還是特發性疾病、感染性疾病所致的FN損傷，華勒氏變性是神經損傷和修復的必經之路，巨噬細胞在華勒氏變性中起到了顯著的作用。周圍神經損傷后，固有巨噬細胞、中性粒細胞和雪旺氏細胞是神經損傷后的第一時間反應者。繼而巨噬細胞發生極化，通過控制IL-4、IL-10、IL-13、CCL2、蛋白酶和生長促進因子等細胞因子，刺激ECM等多種方式參與華勒氏變性和軸突再生過程。因此，進一步研究了解巨噬細胞在PN損傷中發揮的重要作用，對治療FN損傷具有非常重要的理論參考價值。