TMEM16A對(duì)衰老耳蝸血管紋周細(xì)胞凋亡的作用

李雪蕊馮子奕陳龍徐少然鄧雙馬克濤司軍強(qiáng)李麗

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石河子 832000）

2嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室（嘉興 314000）

衰老是任何生命發(fā)展過(guò)程中不可避免的自然過(guò)程。隨著年齡增長(zhǎng)，人體各個(gè)器官會(huì)出現(xiàn)老化，進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)的功能改變。隨著人口老齡化，老年性耳聾的患者也越來(lái)越多[1]。老年性耳聾是由加速的內(nèi)耳細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的一種退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，老年C57BL/6J小鼠[2]和基因缺陷NOD.NONH2nb1/LtJ小鼠[3]中均發(fā)現(xiàn)血管紋毛細(xì)血管有一定程度的缺失，且老年動(dòng)物的耳蝸血管紋毛細(xì)血管周細(xì)胞(Pericytes,PCs)分布密度明顯降低[2]。鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類具有重要生理功能的離子通道，分布非常廣泛[4]，在很多類型的細(xì)胞均有表達(dá)[5]。跨膜蛋白16A（TMEM16A）是CaCCs的主要組成蛋白[6,7]。有研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A可以通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（BASMCs）的凋亡[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)耳蝸血管紋PCs具有平滑肌電生理特性[9]，且豚鼠耳蝸血管紋PCs上廣泛表達(dá)TMEM16A，但TMEM16A在耳蝸血管紋PCs的功能意義還不清楚。本研究通過(guò)原代培養(yǎng)耳蝸血管紋PCs，研究耳蝸血管紋PCs衰老過(guò)程中TMEM16A的變化，以及TMEM16A對(duì)衰老耳蝸血管紋PCs凋亡的影響，從而為CaCCs是否參與豚鼠老齡化過(guò)程中耳蝸血管紋PCs的凋亡提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2周齡左右新生豚鼠，雌雄不拘，體重150-200 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物使用許可證批號(hào)SCXK new 2003-0001），質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本研究中動(dòng)物的使用已獲得石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（許可證號(hào)A2017-168-01）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)

2周齡新生豚鼠4-5只，100 mL/L戊巴比妥鈉(上海生工，武漢)麻醉后斷頭處死，無(wú)菌條件下剪取顳骨，將其浸于4℃D-Hanks液(博士德生物公司)，在顯微鏡下去除多余骨質(zhì)，打開聽泡，分離蝸壁暴露蝸軸，再以顯微鑷撕下整個(gè)血管紋連同螺旋韌帶組織，仔細(xì)分離出血管紋，剪碎血管紋組織塊。在3.5 cm培養(yǎng)皿中加入700 μl的周細(xì)胞選擇培養(yǎng)基：改良的DMEM低糖培養(yǎng)基（DMEM low glucose,Invitrogen,USA），10%胎牛血清（FBS,Sigma,USA），0.1%Pigment epithelium-derived factor(PEDF,Sigma,USA)和1%雙抗（青霉素/鏈霉素，Sigma,USA)）。然后將組織塊平展均勻的擺好在培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2/95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)，并小心加入1 ml完全培養(yǎng)液。以后每天觀察培養(yǎng)液的顏色、外觀和組織塊的顏色，以及細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。1周換液2～3次，10～14天后可通過(guò)消化傳代純化周細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞鑒定

應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察并拍照記錄細(xì)胞的大小、形態(tài)及生長(zhǎng)方式等。選取第5代的細(xì)胞種植到放有玻片的6孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，2天后棄培養(yǎng)基，用37℃預(yù)溫的PBS洗3次，2 min/次。4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，2 min/次，之后2%Triton-x-100透化細(xì)胞3 min，PBS洗3次，2min/次。5%BSA 37℃溫箱封閉30 min，棄封閉液，分別加入周細(xì)胞特異性標(biāo)記物anti-desmin(Abcam公司，英國(guó))和α-SM-actin(Abcam公司，英國(guó))，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF(Abcam公司，英國(guó))一抗，置于濕盒中，4℃過(guò)夜。次日，37℃復(fù)溫30 min，PBS洗3次，2min/次。暗室中加相應(yīng)二抗，37℃恒溫箱中孵育1 h，PBS洗3次，2 min/次，DAPI染核，用抗熒光淬滅劑封片，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡采像，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色確定細(xì)胞衰老模型

選取第5代、第9代和第13代的細(xì)胞分別均勻鋪板置6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，每孔加入1 mL的β-半乳糖苷酶染色固定液（碧云天公司，上海），室溫固定15 min后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次，3 min/次，吸棄PBS，根據(jù)制造商的說(shuō)明配置SA-β-Gal染色液，每孔加入1 mL染色工作液。用保鮮膜封住6孔板置于37℃恒溫箱中孵育過(guò)夜后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)TMEM16A的表達(dá)

選取第5代、第13代的細(xì)胞接種到放有玻片的培養(yǎng)皿，細(xì)胞爬片2天。步驟同前面耳蝸血管紋PCs免疫熒光鑒定。加入TMEM16A一抗（Abcam公司，英國(guó)），置于濕盒中，4℃冰箱過(guò)夜。次日，暗室中加相應(yīng)二抗，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡采像，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 CCK-8確定：TMEM16A阻斷劑T16Ainh-A01合適干預(yù)濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PCs，以1～2×104/mL的密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后更換為無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。后將細(xì)胞分為對(duì)照組和T16Ainh-A01干預(yù)組（分別加入 10、20、30、50 μmol/L T16Ainh-A01），處理24 h后將10 μl CCK-8試劑（碧云天公司，上海）加入各孔中2 h，并使用酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT，USA）測(cè)量450 nm處的吸光度。分析結(jié)果計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.6 膜片鉗記錄PCs上CaCCs激活電流

將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在膜片鉗顯微鏡載物臺(tái)上，100倍鏡下選取膜表面光滑，整體透亮的狀態(tài)良好的PCs作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。選用Sutter Instrument公司生產(chǎn)的帶芯的硼硅酸鹽玻璃毛坯，使用P-2000電極拉制儀（Axon，美國(guó)）拉制成微電極，記錄電極尖端直徑約1 μm，電極阻抗約6～8 MΩ。電極內(nèi)液包含（以 mM 計(jì)）：CsCl 139，MgCl2121，HEPES 10，Na2ATP 3，用CsOH將pH值調(diào)節(jié)至pH 7.35左右。細(xì)胞外溶液包含（以mM計(jì)）：NaCl 130，四乙基銨（TEA）-Cl 5.5，CaCl22.2，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖10，用NaOH將pH值調(diào)節(jié)到7.35左右。加入TEA阻斷鈣激活鉀離子通道電流，加入Na2ATP阻斷ATP敏感鉀離子通道電流。通過(guò)微操縱器使電極尖端接觸到細(xì)胞后，給予負(fù)壓形成G歐封接，補(bǔ)償電極電容后，給予瞬時(shí)較強(qiáng)負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗記錄模式。在電壓鉗模式下（鉗制電壓-40 mV），階躍電壓20 mV，持續(xù)時(shí)間250 ms，記錄膜電容（Membrane Capacity,Cinput），膜電阻（Membrane resistance,Rinput）用以測(cè)量并計(jì)算細(xì)胞的靜息電位（Resting Potential,RP）和電流密度（Current Density,CD）。并觀察用排藥管給予T16Ainh-A01后電流的變化。記錄的信號(hào)經(jīng)MultiClamp 700B放大器（Axon，美國(guó)）放大，給予10 kHz的濾波，并由Digidata 1550A數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Axon，美國(guó)）轉(zhuǎn)換，采樣頻率為10～20 kHz。

1.2.7 Western Blot檢測(cè)TMEM16A、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白

取原代培養(yǎng)的PCs接種到六孔板，加入蛋白裂解液，12000 r/min，4℃離心10 min，取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液后煮沸變性，冷卻后凍存?zhèn)溆谩Ｈ∽冃缘鞍讟悠愤M(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將分離好的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用50 g/L牛奶室溫封閉2 h，然后加入抗體4℃過(guò)夜。第二天TBST緩沖液漂洗，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜。于暗室中滴加發(fā)光試劑，壓片，曝光，顯影，定影，采集圖像后分析各組PCs中TMEM16A、Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白相對(duì)含量。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞按每孔4×105個(gè)的密度接種到六孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜后，給與相應(yīng)藥物干預(yù)，次日收集細(xì)胞，1000rpm離心5min，預(yù)冷的PBS洗滌2遍，每個(gè)待測(cè)樣本管加入500μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI Staining Solution,混勻后，避光孵育30分鐘，將重懸后的液體轉(zhuǎn)移至流式上樣管內(nèi)；流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件分析，數(shù)據(jù)以（）表示，兩獨(dú)立樣本之間均數(shù)的比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)PCs并鑒定

光鏡下，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天可見(jiàn)培養(yǎng)皿內(nèi)組織塊貼壁，細(xì)胞由組織邊緣長(zhǎng)出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞核圓（圖1）。第8～10天可見(jiàn)細(xì)胞增殖，呈典型"鋪路石樣"排列，大約2周可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，并進(jìn)行首次傳代。反復(fù)傳代純化細(xì)胞至第5代，用PCs特異性標(biāo)記物anti-desmin和α-SM-actin，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的細(xì)胞desmin和α-SM-actin表達(dá)陽(yáng)性（圖2A,B），內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物vWF表達(dá)陰性（圖2C），表明原代培養(yǎng)出較純的PCs。

圖1 原代培養(yǎng)耳蝸血管紋PCs：倒置顯微鏡（×400）A：第1天，耳蝸血管紋組織碎片貼壁；B：第5天，耳蝸血管紋組織碎片周圍出現(xiàn)細(xì)胞簇；C：第10天，細(xì)胞擴(kuò)散到整個(gè)培養(yǎng)皿。Fig.1 Primary culture of PCs：Inverted microscope(×400)A:The adherence of the cochlear stria vascular tissue fragments by day 1.B:Cells had begun to grow out from the cochlear stria vascular tissue fragments by day 5.C:The cells spread throughout the culture dish by day 10.

圖2 原代耳蝸血管紋PCs鑒定:熒光倒置顯微鏡（×400）A：desmin表達(dá)陽(yáng)性（綠色）；B：α-SM-actin表達(dá)陽(yáng)性（綠色）；C：vWF表達(dá)陰性Fig.2 The PCs in the Cochlea StriaⅤascularis were identified:Fluorescence inverted microscope(×400)A:The expression of desmin was positive(green).B:The expression of α-SM-actin was positive(green).C:The expression of vWF was negative.

2.2 細(xì)胞衰老模型制備

選連續(xù)傳代到第5、第9和第13代的細(xì)胞均勻鋪置在6孔板內(nèi)，β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示(圖3)，第9代細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色的藍(lán)色陽(yáng)性顆粒較第5代細(xì)胞稍有增多（t=3.005,*P＜0.05），第13代細(xì)胞β-半乳糖苷酶藍(lán)染的陽(yáng)性顆粒較第5代細(xì)胞明顯增多（t=13.57,***P＜0.001），表明PCs培養(yǎng)至第13代出現(xiàn)衰老。

圖3 β-半乳糖苷酶染色：圖A，C，E分別為第5，第9和第13代PCs的染色代表圖（×100）；圖B，D，F(xiàn)分別第5，第9和第13代PCs染色代表圖（×400）。G：染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。Fig.3 PCs are stained with β-Galactosidase.A,C and E:Representative pictures of P5,P9 and P13 PCs(×100).B,D and F:Representative pictures of P5,P9 and P13 PCs(×400).G:Percentage of positively stained P5,P9 and P13 PCs.

2.3 免疫熒光和Western Blot技術(shù)檢測(cè)PCs上TMEM16A表達(dá)變化

免疫熒光結(jié)果顯示：TMEM16A表達(dá)分布位置（如圖4 A,D）。衰老組（第13代）PCs較年輕組（第5代）PCs上TMEM16A熒光強(qiáng)度明顯增多（t=5.102,**P＜ 0.01）(如圖 4 G)。Western Blot結(jié)果顯示：衰老組（第13代）PCs較年輕組（第5代）PCs上TMEM16A蛋白表達(dá)量明顯增多（t=5.989,**P＜0.01）（圖5）。

圖4 免疫熒光檢測(cè)PCs上TMEM16A表達(dá)變化(×400)A，D：TMEM16A的表達(dá)和位置（綠色）；B，E：細(xì)胞核DAPI染色（藍(lán)色）；C，F(xiàn)：合成圖像；G：熒光強(qiáng)度比率。Fig.4 Representative confocal microscopy images of pericytes expressing TMEM16A(×400).A,D:Expression and location of TMEM16A(green).B,E:Nuclear staining by DAPI(blue).C,F:Merged.G:Fluorescemce intensity ratio

圖5 PCs上TMEM16A蛋白表達(dá)變化。A：Western Blot印跡條帶；B：TMEM16A相對(duì)表達(dá)水平。Fig.5 Expression of TMEM16A proteins in PCs.A:Western blot showing expression of TMEM16A in PCs.B:Densitometry analysis of TMEM16A.

2.4 CCK-8檢測(cè)T16Ainh-A01干預(yù)后PCs的活力

將原代培養(yǎng)的PCs分別加入10、20、30和50 μmol/L的T16Ainh-A01處理24 h后，CCK-8檢測(cè)各組PCs的活力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著給予T16Ainh-A01的濃度升高，所測(cè)PCs活力的OD值減小。與對(duì)照組相比細(xì)胞活力下降，20μmol/L T16Ainh-A01干預(yù)組（t=3.811,*P＜0.05），30μmol/L T16Ainh-A01 干 預(yù) 組（t=4.181,*P＜ 0.05），50μmol/L T16Ainh-A01干預(yù)組（t=6.396,**P＜ 0.01），最后選擇30μmol/L的干預(yù)濃度（圖6）。

圖6 CCK-8檢測(cè)不同濃度T16Ainh-A01干預(yù)后PCs活性。Fig.6 CCK-8 test for PCs viability with different concentrations of T16Ainh-A01.

2.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄CaCCs電流

利用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式記錄培養(yǎng)至第5代和第13代的PCs激活電流。如圖7B所示，與對(duì)照組相比，衰老組（第13代）PCs的外向電流密度升高（t=5.269,**P＜0.01）。使用CaCCs通道的特異性阻斷劑T16Ainh-A01后，抑制了PCs的外向電流。將使用阻斷劑T16Ainh-A01前后的激活電流相減，可以獲得CaCCs的凈電流（圖7C），與年輕組（第5代）PCs相比，衰老組（第13代）的凈電流升高（t=3.471,*P＜0.05）。培養(yǎng)至第5代和第13代的PCs上CaCCs介導(dǎo)的凈電流變化趨勢(shì)與總的PCs激活外向電流相似。上述結(jié)果顯示第13代衰老組PCs上CaCCs開放增加，外向電流增強(qiáng)，給予阻斷劑T16Ainh-A01干預(yù)后可抑制此外向電流。

圖7 CaCCs的凈電流和電流密度變化。A：CaCCs的外向電流;B：CaCCs電流密度曲線;C：CaCCs凈電流曲線。Fig.7 The current density and net current change of CaCCs.A:The outward current of CaCCs.B:The current density curve of CaCCs.C:The net current curve of CaCCs.

2.6 Western Blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的變化

如圖8結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的衰老組（第13代）PCs與年輕組（第5代）PCs相比，凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表達(dá)水平升高（t=6.492,**P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)水平升高（t=6.784,**P＜0.01），Bcl-2的表達(dá)水平明顯下降（t=10.29,***P＜0.001）。衰老組給予30 μmol/L 的T16Ainh-A01干預(yù)24 h后，PCs中凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯下降（t=9.163,###P＜0.001），Bax的表達(dá)下降（t=3.638,#P＜0.05），Bcl-2的表達(dá)明顯上升（t=5.747,##P＜0.01）。

圖8 PCs上Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白變化。A：Western Blot條帶；B：Caspase-3蛋白表達(dá)水平；C：Bax蛋白表達(dá)水平；D：Bcl-2蛋白表達(dá)水平。Fig.8 The changes of Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in PCs.A:Expression of the protein bands.B:Densitometry analysis of Caspase-3.C:Densitometry analysis of Bax.D:Densitometry analysis of Bcl-2.

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化

如圖9結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的衰老組（第13代）PCs與年輕組（第5代）PCs相比，細(xì)胞凋亡率明顯升高（t=13.63,***P＜0.001），衰老組（第13代）PCs給予30 μmol/L 的T16Ainh-A01干預(yù)24 h后，細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)明顯下降（t=7.640,##P＜0.01）。

3 討論

耳蝸血管紋PCs作為血迷路屏障（blood-labyrinth barrier,BLB）的重要組成，在維持血管紋穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)BLB通透性中起重要作用[11-13]。目前對(duì)血管紋PCs的研究主要集中在形態(tài)學(xué)方面[4,13,14]，對(duì)其具體機(jī)制方面的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)成功建立血管紋PCs體外模型，選用連續(xù)傳代法制備細(xì)胞衰老模型，研究發(fā)現(xiàn)衰老的耳蝸血管紋PCs凋亡增多，TMEM16A表達(dá)增多，TMEM16A特異性阻斷劑（T16Ainh-A01）可以減少細(xì)胞凋亡。

在聽力與TMEM16A的研究中發(fā)現(xiàn)，TMEM16A在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[15]，耳蝸血管紋基底細(xì)胞[16]和耳蝸內(nèi)支持細(xì)胞(ISCS)中高度表達(dá)[17]。前期本課題組在體研究發(fā)現(xiàn)，TMEM16A在豚鼠耳蝸血管紋PCs上廣泛表達(dá)，且存在年齡相關(guān)性變化[10]。正如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在連續(xù)傳代后第13代衰老耳蝸血管紋PCs上TMEM16A表達(dá)上調(diào)，表明TMEM16A與衰老耳蝸血管紋PCs之間存在重要的關(guān)聯(lián)。

圖9 各組PCs凋亡情況；A：第5代PCs凋亡率；B：第13代PCs凋亡率；C：DMSO溶劑組；D：第13代PCs給予T16Ainh-A01后細(xì)胞凋亡率。Fig.9 The apoptosis rate of PCs in each group.A:The apoptosis rate of P5 PCs.B:The apoptosis rate of P13 PCs.D:The apoptosis rate of P13 PCs after T16Ainh-A01 intervention.

TMEM16A的表達(dá)和功能因細(xì)胞種類而異，早先研究只發(fā)現(xiàn)TMEM16A與腫瘤細(xì)胞密切相關(guān)[18,19]。最近有研究表明TMEM16A還可通過(guò)線粒體途徑促進(jìn)腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（BASMCs）的凋亡，使Caspase-9和Caspase-3活化，Bax表達(dá)增加[8]。許多研究發(fā)現(xiàn)老年性耳聾可引起耳蝸細(xì)胞變性，細(xì)胞自噬與凋亡增加[20,21]，TMEM16A與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但TMEM16A對(duì)老年性耳聾中耳蝸血管紋PCs凋亡的影響尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與年輕組細(xì)胞相比，衰老組細(xì)胞凋亡率明顯增多，凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)增多；在給與TMEM16A的特異性阻斷劑T16Ainh-A01后，衰老組的細(xì)胞凋亡率下降，Caspase-3、Bax表達(dá)明顯減少，提示TMEM16A可能與衰老耳蝸血管紋PCs的凋亡密切相關(guān)。

CaCCs具有Ca2+濃度依賴和電壓依賴性的電生理特性[22]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CaCCs通道開放可使I（Cl-）外流增多，細(xì)胞膜去極化，有利于 Ca2+通過(guò)電壓依賴性鈣通道(VDCC)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高[23,24]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄到原代培養(yǎng)的耳蝸血管紋衰老組PCs上CaCCs電流密度較年輕組有所增大，CaCCs開放增加，可能使Ca2+內(nèi)流增加，耳蝸血管紋PCs內(nèi)Ca2+濃度失衡可能造成耳蝸血管紋PCs的凋亡。

綜上所述，TMEM16A可能作為耳蝸血管紋PCs凋亡的調(diào)節(jié)蛋白分子，促進(jìn)PCs的凋亡進(jìn)而影響耳蝸血管紋毛細(xì)血管的功能，但是其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。