石墨烯對(duì)氧化應(yīng)激引起的毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

董健菲陸玲林川耀劉勇周函朱成文潘明潔唐明亮高下*

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（南京 210008）

2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉研究所（南京 210008）

3南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（南京 210008）

4東南大學(xué)生命科學(xué)院（南京 210096）

各種原因?qū)е碌穆?tīng)力下降，是引起言語(yǔ)交流困難的主要原因，大大降低了耳聾患者的生活質(zhì)量[1]。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)2005年全球聽(tīng)力障礙人數(shù)為2.78億，占全球人口的4.6%。耳聾已成為影響社會(huì)政治和經(jīng)濟(jì)的全球性健康問(wèn)題。

由內(nèi)耳缺血、缺氧、噪聲和耳毒性藥物等引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷與氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)[2-6]。細(xì)胞在進(jìn)行有氧呼吸時(shí)，線粒體內(nèi)氧分子通過(guò)質(zhì)子耦合和電子轉(zhuǎn)移等過(guò)程被還原生成水，反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的能量用于合成三磷酸腺苷(ATP)。其中約1～2%的氧分子未徹底被還原，形成超氧陰離子自由基(·O2-)、羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)和過(guò)氧化氫(H202)等ROS?；钚匝醴e聚會(huì)導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)，破壞細(xì)胞膜，改變細(xì)胞通透性，引起DNA損傷，導(dǎo)致蛋白酶失活和脂肪過(guò)氧化等效應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞炎癥，甚至凋亡等[7]。目前，大多數(shù)理論認(rèn)為內(nèi)耳聽(tīng)覺(jué)相關(guān)毛細(xì)胞線粒體的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS增多，超出自身的清除能力,造成上述細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)氧化損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化,從而導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷[8]。與此同時(shí)，ROS還可作為細(xì)胞內(nèi)信使激活一系列細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。直接誘導(dǎo)內(nèi)耳毛細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致聽(tīng)力損失[9]。

氧化應(yīng)激損傷一直以來(lái)是耳科學(xué)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題，盡管降低內(nèi)耳中ROS的水平、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)是目前治療耳聾的重要手段，但目前還沒(méi)有找到能有效減輕氧化應(yīng)激的方法。本文擬研究CVD法制備的石墨烯對(duì)于氧化應(yīng)激損傷后類(lèi)毛細(xì)胞系的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。CVD法是使用含碳化合物作碳源，碳源在高溫下裂解后，與基底相互作用后在其表面生長(zhǎng)形成石墨烯。它是目前最具前瞻性、成本低、易于制備大面積高質(zhì)量石墨烯的方法。CVD法可用于生產(chǎn)具有單一結(jié)晶度的石墨烯，并且可以很容易應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)[10]。

Lasocka等人研究發(fā)現(xiàn)CVD法制備的石墨烯薄膜對(duì)L929成纖維細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性，且可以增加L929成纖維細(xì)胞的粘附力[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，石墨烯特殊的理化性質(zhì)決定了它具有一定的吸附能力，能夠清除一定的ROS[12]，從而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激。但目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道石墨烯對(duì)氧化應(yīng)激引起的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且其作用機(jī)制也尚不清楚。因此，本文擬通過(guò)cck-8檢測(cè)法、免疫熒光檢測(cè)法、流式分析法、TUNNEL檢測(cè)法等研究石墨烯對(duì)氧化應(yīng)激引起的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其具體機(jī)制，但本次實(shí)驗(yàn)為體外基礎(chǔ)研究，將來(lái)能否將石墨烯應(yīng)用于臨床，還需要更多的體內(nèi)研究進(jìn)行驗(yàn)證，本研究?jī)H能為治療和預(yù)防耳聾提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 所用材料

本研究應(yīng)用的石墨烯材料購(gòu)買(mǎi)自南京牧科納米有限公司，是采用CVD（化學(xué)氣相沉淀法）制備的二維石墨烯材料。該石墨烯的制備是在Cu（銅基）上進(jìn)行的。具體的制備方法見(jiàn)圖1、2。

圖1 銅基石墨烯轉(zhuǎn)移流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of transfer process of copper-based graphene

圖2 上圖中是將二維石墨烯轉(zhuǎn)移到襯底材料SiO2上，本研究是將二維石墨烯轉(zhuǎn)移到襯底材料TCPs（TC玻片）上。Fig.2 In the above figure,2D graphene is transferred to the SiO2-based material.But in this study,2D graphene is transferred to the TCPs(TC-treated coverslips).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

采用HEI-OC1細(xì)胞系（House Ear Institute-Organ of Corti 1），該細(xì)胞系作為體外耳蝸毛細(xì)胞研究的模型系統(tǒng)，可以表達(dá)多種毛細(xì)胞marker，包括鈣結(jié)合蛋白、鈣調(diào)蛋白、Math1、Myosin7a、Prestin等[13]。

1.1.3 主要試劑

H2O2、氨芐青霉素購(gòu)于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于維森特公司；胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)于Invitrogen公司；cck-8試劑盒購(gòu)于同仁公司；兔抗myosin7a單克隆抗體購(gòu)于Proteus Bioscience公司；DAPI、DCFH-DA購(gòu)于Solarbio公司；Mito-sox購(gòu)于Life公司；TUNNEL試劑盒購(gòu)于Vazyme公司；HEI-OC1細(xì)胞系完全培養(yǎng)基(50ml):DMEM 45ml;10%FBS 5ml;100mg/ml AMP(氨芐青霉素)50μl。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石墨烯材料的處理

二維石墨烯在超凈臺(tái)中紫外照射24h。用75%乙醇浸泡24h。用ddH2O浸泡12h。用完全培養(yǎng)基浸泡二維石墨烯，置于37℃、5%CO2飽和水汽恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。

1.2.2 cck-8檢測(cè)法

分別在24孔皿中加入5片2D-G和5片TCPs，以此作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，處理材料。每孔接種4x104/ml的細(xì)胞懸液500μl。置于 37℃、5%CO2飽和水汽恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。然后每孔分別加入 500μmol/l、750μmol/l、1mmol/l、2mmol/l、5mmol/l的H2O2，置于培養(yǎng)箱中分別孵育4h和12h。每孔中分別加入10%的cck-8試劑，輕輕搖勻，37℃，避光孵育1h。將24孔皿中的培養(yǎng)基吸出，按照不同H2O2濃度將其轉(zhuǎn)移至96孔皿。將96孔皿置于酶標(biāo)儀中，檢測(cè)每孔的OD值。

1.2.3 免疫熒光法

分別在24孔皿中加入TCPs和2D-G，以此作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，處理材料。每孔接種8x104/ml的細(xì)胞懸液500μL。細(xì)胞培養(yǎng)24h后加不同濃度H2O2作用4/12h鑒定毛細(xì)胞標(biāo)記物Myosin 7a（1:1000稀釋?zhuān)┑谋磉_(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)后加500μmol/l H2O2處理4h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS（DCFH-DA/MitoSOX 1:1000稀釋?zhuān)┧健?/p>

1.2.4 流式分析法

分別在6孔皿中加入3片2D-G/孔和3片TCPs/孔，以此作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，處理材料。每孔接種1×105/ml的細(xì)胞懸液1mL。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加500μmol/L H2O2處理，培養(yǎng)箱中避光孵育4h。用無(wú)菌1×PBS洗一遍。分別將配好的DCFH-DA(1:1000)/MitoSOX(1:1000)混合培養(yǎng)基加入到樣品孔，每孔1ml。置于培養(yǎng)箱中避光孵育30/10分鐘。用DMEM/PBS洗三遍。每孔加入1mL 0.25%Trypsin，置于培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。體視顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待貼壁細(xì)胞成團(tuán)漂起時(shí)，加入1mL完全培養(yǎng)基，終止消化。1000轉(zhuǎn)每分鐘（rpm），離心5分鐘。棄上清，每管加入300μL 1×PBS，用移液槍吹打均勻。然后將細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到流式專(zhuān)用管。上機(jī)，分析。（注：整個(gè)操作過(guò)程中注意避光）

1.2.5 TUNNEL檢測(cè)法

分別在24孔皿中加入2D-G和TCPs，以此作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，處理材料。每孔接種8×104/ml的細(xì)胞懸液500μL。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后加500μmol/L H2O2處理，培養(yǎng)箱中避光孵育4h。用無(wú)菌1×PBS洗一遍。然后加入4%PFA，常溫固定1h。棄4%PFA，然后用PBST 5分鐘/次，洗三遍。每孔加入1mL Blocking medium，常溫孵育1h。將TUNNEL試劑盒中的5×buffer用ddH2O稀釋為1×buffer，覆蓋過(guò)細(xì)胞，室溫放置30分鐘。配制TdT緩沖液：5×buffer 10μl；FITC Mixture 5μl；TdT Enzyme 1μl；ddH2O 34μl；Total 50μl。去除1xbuffer，將TdT緩沖液覆蓋細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中分別避光孵育1h。棄緩沖液，1xPBS清洗兩次，每次洗5分鐘。加入配好的 DAPI（DAPI:PBT-2=1：1000）染色液，室溫孵育30-60分鐘。1xPBS清洗三次，每次5分鐘。每片表面滴加6μl DAKO封片液，然后用指甲油封片。Confocal拍照。（注：整個(gè)封片過(guò)程中注意避光）

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

本研究使用GraphPad Prism6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以，用于不同濃度H2O2處理后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間細(xì)胞存活率的比較采用雙因素方差分析，組間比較采用Sidak’s檢驗(yàn)。兩組間的活性氧水平和凋亡水平的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001。

2 結(jié)果

2.1 石墨烯能夠顯著提高短期氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞的存活率

不同濃度H2O2處理4h后，2D-G組(二維石墨烯組，即實(shí)驗(yàn)組)與TCPs組(TC玻片，即對(duì)照組)的細(xì)胞存活率采用雙因素方差統(tǒng)計(jì)分析得出H2O2、材料及兩者結(jié)合對(duì)細(xì)胞存活率均有影響（F=703.1,P＜0.0001;F=41.39,P＜0.0001;F=2.936,P=0.0225），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需進(jìn)行兩兩比較。組間比較用Sidak’s檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率在 500μmol/L(P＜0.05)、750μmol/L(P＜0.05)、1mmol/L(P＜0.01)H2O2濃度下提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中500μmol/L和750μmol/L H2O2濃度下細(xì)胞存活率維持在80%以上，1mmol/L濃度下細(xì)胞存活率維持在60%以上(圖3)。圖4為不同濃度H2O2處理4h后，HEI-OC1細(xì)胞數(shù)目隨H2O2濃度的提高而減少，但實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組多的免疫熒光圖。

圖3 H2O2處理4h后，2D-G（二維石墨烯）和TCPs（TC玻片）上HEI-OC1細(xì)胞的存活率(CCK-8檢測(cè)法)Fig.3 The survival rate of HEI-OC1 cell grown on 2D-G and TCPs after H2O2treatment for 4h(CCK-8 test)

圖4 H2O2處理4h后，2D-G（二維石墨烯）和TCPs（TC玻片）上HEI-OC1細(xì)胞的存活情況(40x激光共聚焦顯微鏡)Fig.4 The survival of HEI-OC1 cell grown on 2D-G and TCPs after H2O2treatment for 4h(40x laser confocal microscope)

2.2 石墨烯能夠顯著提高較長(zhǎng)時(shí)間氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞的存活率

不同濃度H2O2處理12h后，2D-G組與TCPs組的細(xì)胞存活率采用雙因素方差統(tǒng)計(jì)分析得出H2O2、材料及兩者結(jié)合對(duì)細(xì)胞存活率均有影響（F=1815,P＜0.0001;F=212.8,P＜0.0001;F=2.954,P=0.0044），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需進(jìn)行兩兩比較。組間比較用Sidak’s檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率在500μmol/L(P＜0.0001)、750μmol/L(P＜0.001)H2O2濃度下提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中500μmol/L濃度下細(xì)胞存活率維持在80%左右，750μmol/L H2O2濃度下細(xì)胞存活率維持在60%以上(圖5)。圖6為不同濃度H2O2處理12h后，HEI-OC1細(xì)胞數(shù)目隨H2O2濃度的提高而減少，但實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組多的免疫熒光圖。

圖5 H2O2處理12h后，2D-G（二維石墨烯）和TCPs（TC玻片）上HEI-OC1細(xì)胞的存活率Fig.5 The survival rate of HEI-OC1 cell grown on 2D-G and TCPs after H2O2treatment for 12h(cck-8 test)

圖6 H2O2處理12h后，2D-G（二維石墨烯）和TCPs（TC玻片）上HEI-OC1細(xì)胞的存活情況(40x)Fig.6 The survival of HEI-OC1 cell grown on 2D-G and TCPs after H2O2treatment for 12h(40x)

根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選取500μmol/L的H2O2濃度作為較適濃度，4h作為較適處理時(shí)間，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 石墨烯能夠顯著降低氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)的ROS水平

2.3.1 石墨烯能夠顯著降低氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

用500μmol/L H2O2處理4h后，2D-G組與TCPs組細(xì)胞內(nèi)總體ROS水平免疫熒光強(qiáng)度（,n=5）分別為36.73±1.398,48.97±3.614。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)總體ROS水平低于對(duì)照組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。流式分析表明細(xì)胞內(nèi)總體ROS水平熒光強(qiáng)度（,n=3）分別為248.7±2.333,932.7±14.75，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。

圖7 H2O2處理后,石墨烯組與對(duì)照組HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)總體ROS水平比較(40x激光共聚焦顯微鏡)(±s,n=5)Fig.7 Comparison of the overall intracellular ROS levels of HEI-OC1 between the graphene group and the control group after H2O2treatment(40x laser confocal microscope)(±s,n=5)

圖8 H2O2處理后,流式分析石墨烯組與對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的總體ROS水平(±s,n=3)Fig.8 Flow analysis of total ROS levels in cells of the graphene group and the control group after H2O2treatment(±s,n=3)

2.3.2 石墨烯能夠顯著降低氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1線粒體內(nèi)的ROS水平

2D-G組與TCPs組線粒體內(nèi)ROS水平免疫熒光強(qiáng)度(,n=6）分別為 32.77±2.180,43.67±3.175。實(shí)驗(yàn)組線粒體內(nèi)ROS水平低于對(duì)照組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9)。流式分析表明線粒體內(nèi)ROS水平熒光強(qiáng)度(,n=3)分別為1457±15.18,1537±19.55，實(shí)驗(yàn)組線粒體內(nèi)ROS水平低于對(duì)照組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖10)。

圖9 H2O2處理后,石墨烯組與對(duì)照組HEI-OC1細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平比較(40x)(±s,n=6)Fig.9 Comparison of mitochondrial ROS levels in HEI-OC1 cells between the graphene group and the control group after H2O2treatment(40x)(±s,n=6)

圖10 H2O2處理后,流式分析石墨烯組與對(duì)照組細(xì)胞線粒體內(nèi)的ROS水平(±s,n=3)Fig.10 Flow analysis of ROS levels in mitochondria of cells in the graphene group and the control group after H2O2treatment(±s,n=3)

2.4 石墨烯能夠顯著降低氧化應(yīng)激后耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞的凋亡水平

用500μmol/L H2O2處理4h后，石墨烯組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率(,n=6)分別為0.1799±0.01753,0.3320±0.05193，石墨烯組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖11)。

圖11 H2O2處理后，石墨烯組與對(duì)照組HEI-OC1細(xì)胞凋亡水平的比較(40x)(±s,n=6)Fig.11 Comparison of apoptosis levels of HEI-OC1 cells in the graphene group and the control group after H2O2treatment(40x laser confocal microscope)(±s,n=6)

3 討論

H2O2損傷后HEI-OC1細(xì)胞存活率和活性氧檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)石墨烯能夠清除HEI-OC1細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體內(nèi)的ROS，提高細(xì)胞的存活率。石墨烯自2004年被Andre Geim和Konstantin Novoselov首次發(fā)現(xiàn)后便引發(fā)研究熱潮，國(guó)內(nèi)外都報(bào)道了許多石墨烯在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面的工作。石墨烯是碳原子以sp2雜化軌道形成的六角蜂窩晶格的二維結(jié)構(gòu)，由于其具有獨(dú)特的物化性質(zhì)，例如：高比表面積、高電荷遷移率、良好的機(jī)械強(qiáng)度等，已經(jīng)在藥物運(yùn)輸[14]、生物分析[15]、干細(xì)胞工程[16]及腫瘤治療[17]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出很大的潛力。石墨烯作為一類(lèi)新型的抗氧化劑，其擁有物理屏蔽作用和超高的表面積，具有清除自由基的作用[18]。

隨后我們進(jìn)行了H2O2損傷后HEI-OC1細(xì)胞凋亡率檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明石墨烯能夠減輕氧化應(yīng)激引起的HEI-OC1細(xì)胞凋亡。在生理和病理狀態(tài)下，活性氧在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面都發(fā)揮著重要作用[19]。既往研究表明，氧化應(yīng)激可以通過(guò)激活外源性細(xì)胞死亡受體和內(nèi)源性線粒體細(xì)胞凋亡通路來(lái)引發(fā)凋亡[20]。ROS主要通過(guò)兩種途徑來(lái)誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡，即通過(guò)Caspase誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡[21]和活化MAPK/JNK信號(hào)通路引發(fā)凋亡[22,23]。ROS水平的提高和隨后凋亡的發(fā)生參與了耳聾病理的發(fā)展[24]。

我們大膽的猜想，能否將石墨烯材料通過(guò)圓窗給藥的方式注射到耳蝸內(nèi)。但用于本次研究的石墨烯為二維固體石墨烯，故通過(guò)圓窗給藥注射到耳蝸仍有很大的難度。石墨烯與水凝膠的復(fù)合材料為有效解決這一難題提供了新的思路，目前有較多關(guān)于石墨烯衍生物與水凝膠組成的復(fù)合材料用于疾病治療的模型。如石墨烯-氧化物（GO）增強(qiáng)聚合物水凝膠（GPH）作為有前途的栓塞劑，能夠使用經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈栓塞（TAE）技術(shù)來(lái)治療腦血管疾病和惡性腫瘤[25]。Arghya Paul等人開(kāi)發(fā)了一種可注射且具有生物相容性的水凝膠，該凝膠可以有效地遞送GO和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165（VEGF）促血管生成基因的納米復(fù)合物，用于心肌治療[26]。在最新的研究中，Cosimo Ligorio等人利用GO作為納米填料來(lái)設(shè)計(jì)混合可注射3D支架，以輸送髓核細(xì)胞（NPC）用于椎間盤(pán)再生。因此，這些雜化水凝膠具有作為可注射支架用于髓核細(xì)胞體內(nèi)遞送的巨大潛力[27]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，石墨烯及其家族根據(jù)層數(shù)，橫向尺寸可分為潛在的可吸入和不可吸入兩種類(lèi)型。大多數(shù)橫向尺寸大于20μm的商業(yè)化的幾層石墨烯仍處于可吸入?yún)^(qū)域（空氣動(dòng)力學(xué)直徑（Daa）＜5μm），因?yàn)樗鼈兂?，但在肺部沉積后可能無(wú)法有效清除。沉積在鼻咽和氣管支氣管中的可吸入石墨烯顆?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)被該部位的粘膜纖毛通過(guò)“粘膜自動(dòng)扶梯”途徑清除。沉積在肺泡內(nèi)的可吸入石墨烯顆?？梢酝ㄟ^(guò)特殊細(xì)胞-肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴結(jié)進(jìn)行清除，但過(guò)程需要數(shù)月至數(shù)年時(shí)間。然而巨噬細(xì)胞成功吞噬板狀石墨烯顆粒并保留足夠的運(yùn)動(dòng)清除能力的研究尚待進(jìn)一步進(jìn)行[28]。腺嘌呤二核苷酸氧化酶（通?？s寫(xiě)為NOX）是在吞噬細(xì)胞中表達(dá)的多蛋白復(fù)合物，可催化超氧化物的產(chǎn)生。反過(guò)來(lái)，超氧化物歧化形成過(guò)氧化氫，髓過(guò)氧化物酶（MPO）催化次氯酸的形成，次氯酸是具有殺微生物作用的可自由擴(kuò)散的氧化劑，髓過(guò)氧化物酶和次氯酸都可以降解碳基納米材料。此外，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和一氧化氮反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝酸鹽，可以消化巨噬細(xì)胞中的納米材料[29]。

目前有關(guān)石墨烯毒性機(jī)制的研究主要集中于線粒體損傷、DNA損傷、炎性反應(yīng)、凋亡等終點(diǎn)及氧化應(yīng)激參與的復(fù)雜信號(hào)通路。但不同石墨烯納米材料的濃度、層數(shù)、尺寸、形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)、進(jìn)入機(jī)體途徑、存在部位等對(duì)石墨烯的生物毒性影響差別較大。目前大部分文章都是關(guān)于石墨烯短暫停留機(jī)體的毒性研究，如果石墨烯長(zhǎng)期滯留機(jī)體組織內(nèi)是否危害健康還有待進(jìn)一步研究[30]。

綜上所述，本研究中石墨烯可能是通過(guò)清除細(xì)胞外ROS濃度來(lái)降低細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，從而減輕細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)毛細(xì)胞的作用。