大鼠膜迷路積水模型的建立及評定

王娜李旻王靜張麗李偉蘭劉汝利張萍何芳

1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（唐山 063000）

2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院骨科（唐山 063000）

3定州市人民醫(yī)院康復(fù)科（定州 073000）

4華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院急診科（唐山 063000）

5華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院放射影像科（唐山 063000）

梅尼埃病（Meniere’s disease）是一種發(fā)病機理錯綜復(fù)雜的內(nèi)耳疾病[1]。雖然關(guān)于其病因了解甚少[2]，但膜迷路積水作為梅尼埃病的主要病理變化[3]已得到了許多學(xué)者的證實[4]。建立膜迷路積水豚鼠動物模型存在價格昂貴，對于氣候適應(yīng)性差，不方便操作，病死率高，模型制備成功率低等缺點[5,6]。為了避免豚鼠造模的這些不足，本實驗以SD大鼠為研究對象，腹腔注射DDAVP，探討建立大鼠膜迷路積水模型及評定方法[7]，為進(jìn)一步研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康SD大鼠30只（北京華阜康生物科技公司提供），雌雄不限，3～6月齡，體重160～210 g。納入標(biāo)準(zhǔn):耳廓反射敏銳，鼓膜無異常，無眼震及平衡障礙。已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

30只大鼠隨機分3組，實驗組與對照組以4μg/kg/d分別將DDAVP、生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射7d后調(diào)整劑量為6μg/kg/d，繼續(xù)連續(xù)注射3d[8]，停止用藥7d后分別對實驗組及對照組大鼠行ABR檢測，正常組不作任何處理，17d后行ABR檢測。

1.3 ABR檢測

在聲-電屏蔽室內(nèi)對實驗動物行ABR檢測，5%水合氯醛（350mg/Kg）麻醉成功后，大鼠俯臥，前額正中皮下、鼻根部、耳廓后下端皮下分別放置記錄電極、接地電極、參考電極，刺激聲為短聲(click)，重復(fù)率21.1次/秒，刺激頻率為100～3000Hz，記錄持續(xù)時間15ms，疊加1024次，檢測大鼠ABR各指標(biāo)變化。

1.4 HE染色

實驗動物深度麻醉后，以生理鹽水和4%多聚甲醛依次行心臟灌注，斷頭并盡快取出耳蝸，浸泡于0.01mol/L PBS緩沖液，于蝸頂鉆孔并突破圓窗、卵圓窗膜后，在顯微鏡下用固定液耳蝸內(nèi)灌注，在4℃下多聚甲醛PBS緩沖液浸泡12小時。緩沖液浸洗30min后室溫下用10%EDTA二鈉溶液脫鈣14天。梯度酒精脫水，石蠟包埋、切片（4μm層厚）、HE染色觀察(見圖1)。

圖1 耳蝸蝸管及前庭膜變化情況（A：正常組；B：對照組；C、D：實驗組，100x）Fig.1 Cochlear canal and vestibular membrane changes(A:Normal group;B:Control group;C and D:Experimental group,100x)

1.5 膜迷路積水的評價

采用軟件分析系統(tǒng)分別計算三組大鼠SM與SM+SV，（見圖2）將各組SM/SM+SV的平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

圖2 膜迷路積水的評價圖（A：正常組；B：對照組；C：實驗組，100x）Fig.2 Evaluation of endolymphatic hydrops(A:Normal group;B:Controlgroup;C:Experimental group,100x)

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功率

實驗組10只大鼠中有1只在造模過程中無明顯行為學(xué)改變，未出現(xiàn)明顯聽力下降，耳蝸切片HE染色前庭膜平坦，未出現(xiàn)變形，SM與SM+SV基本等于1/3，建立模型率達(dá)90%，符合建模成功率標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 大鼠日常行為變化

實驗初期，三組的大鼠自發(fā)活動及耳廓反射均正常，造模10天后，實驗組大鼠逐漸出現(xiàn)了自發(fā)活動的減少、聽覺不靈敏、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀，但是并未出現(xiàn)眼球震顫的表現(xiàn)，而正常組和對照組大鼠均未出現(xiàn)上述癥狀。

2.3 ABR結(jié)果

通過ABR檢測三組大鼠聽力：通過單因素方差分析比較，實驗組Ⅱ波的閾值、Ⅱ波、Ⅴ波的潛伏期及Ⅲ～Ⅴ波間期與其它兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

2.4 耳蝸HE染色結(jié)果

正常組及對照組耳蝸中階（即蝸管）無明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，前庭膜平坦，未出現(xiàn)變形，而實驗組耳蝸中階發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，前庭膜向前庭階的方向隆起或斷裂（見圖1）。

2.5 膜迷路積水的評價

實驗組大鼠的SM與SM+SV比值大于1/3，而正常組和對照組SM與SM+SV基本等于1/3。實驗組與其它兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），正常組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

3 討論

梅尼埃病的病因錯綜復(fù)雜，目前沒有定論，一直處于探討中[9]，Hallpike教授等[10]首次報道膜迷路積水是其主要病理基礎(chǔ)后，許多學(xué)者開始通過動物實驗來進(jìn)一步研究其發(fā)病機理。研究者主要以豚鼠建立膜迷路積水模型，本實驗以SD大鼠為研究對象，通過腹腔注射DDAVP成功造模，較傳統(tǒng)的以豚鼠制備模型，動物容易采購，價格更低，飼養(yǎng)環(huán)境要求不高等優(yōu)點。

針對豚鼠膜迷路積水動物造模的方法和特點進(jìn)行歸納總結(jié)[11]，分為急性和慢性。急性膜迷路積水模型：①低頻噪聲誘發(fā)Flock、Salt等[12,13]利用噪聲和增加內(nèi)淋巴靜態(tài)壓誘導(dǎo)豚鼠膜迷路積水；②人工內(nèi)淋巴液注射。Kakigi等[14]通過向耳蝸內(nèi)注射人工內(nèi)淋巴液誘導(dǎo)急性膜迷路積水；③霍亂毒素注射Feldman等[15]通過豚鼠耳蝸中階注射霍亂毒素誘導(dǎo)出豚鼠膜迷路積水模型；④透明質(zhì)酸凝膠注射Salt等[16]通過將透明質(zhì)酸凝膠注入豚鼠耳蝸來誘導(dǎo)膜迷路積水模型。慢性膜迷路積水模型包括：①內(nèi)淋巴囊手術(shù)法；②內(nèi)分泌調(diào)節(jié)法：許多學(xué)者通過腹腔注射血管加壓素及腹腔注射醛固酮建立豚鼠膜迷路積水模型；③免疫誘導(dǎo)法；④綜合法。

上述在豚鼠造模方法中均存在優(yōu)缺點，其中缺點有實驗方法復(fù)雜、難以掌握、破壞性大、造模周期長、造模成功率低等。內(nèi)分泌調(diào)節(jié)法中的腹腔注射血管加壓素法誘導(dǎo)膜迷路積水模型是近年來研究MD動物實驗常用的方法。本研究通過注射DDAVP，DDAVP是AVP的類似物，機體通過激活A(yù)VP/AQP2通路調(diào)節(jié)體內(nèi)水的代謝，DDAVP受體V2R主要分布在腎臟，V2R被激活后使cAMP表達(dá)增加，而cAMP表達(dá)增加后誘導(dǎo)AQP2的表達(dá)水平提高，加速腎臟對水的重吸收[17]，有研究表明此通路在膜迷路積水的病理變化中也起著重要作用[18]，當(dāng)體內(nèi)DDAVP水平升高時通過此通路促使膜迷路積水發(fā)生[19]，通過DDAVP受體拮抗劑可以抑制膜迷路積水的進(jìn)展[20]，DDAVP抗利尿作用更加強大，在內(nèi)耳組織中與其受體結(jié)合，兩者相互作用誘導(dǎo)膜迷路積水發(fā)生。

表1 三組大鼠ABR檢測結(jié)果（±s）Table 1 Results of ABR detection of three groups of rats（±s）

表1 三組大鼠ABR檢測結(jié)果（±s）Table 1 Results of ABR detection of three groups of rats（±s）

Note:Experimental ABR Ⅱ wave threshold,Ⅱ,Ⅴwave incubation period andⅢ～Ⅴ between wave period,compared to the other two groups(n1=n2=10,n3=9).Using single factor analysis of variance between groups,moreⅡ wave higher threshold(P=0.000＜0.05);AndⅡ wave incubation period(P=0.004＜0.05),Ⅴ wave incubation period(P=0.000＜0.05)and between Ⅲ～Ⅴ wave period(P=0.006＜0.05)significantly prolonged.

Group Normal group Control group Experimental group ABR latency(ms)ABR threshold(dBn HL)Ⅱ47.18±3.71 48.45±2.51 56.35±3.80 21.460 0.000Ⅱ1.58±0.08 1.57±0.09 1.73±0.13 6.859 0.004ⅢⅤF P 2.26±0.10 2.27±0.04 2.30±0.09 1.041 0.367 4.09±0.08 4.06±0.06 4.24±0.08 18.133 0.000 ABR wave of interphase(ms)Ⅱ～Ⅴ2.51±0.01 2.48±0.04 2.53±0.06 3.301 0.052Ⅲ～Ⅴ1.81±0.04 1.79±0.02 1.94±0.17 6.159 0.006

表2 大鼠耳蝸中階（即蝸管）與中階加前庭階橫截面積及兩者之比（±s）Table 2 Cross-sectional area of cochlear canal and cochlear canal plus vestibular stepand their ratio（±s）

表2 大鼠耳蝸中階（即蝸管）與中階加前庭階橫截面積及兩者之比（±s）Table 2 Cross-sectional area of cochlear canal and cochlear canal plus vestibular stepand their ratio（±s）

Note:In the experimental group,SM/SM+SⅤ was compared with the other two groups(n1=n2=10,n3=9).One-way ANOⅤA between groups was used,and F=39.053,P=0.000＜0.05;a was compared with the normal group,b was compared with the control group,c was compared with the normal group,aP＜0.05;bP＜0.05;cP＞0.05.

Area ratio(SM+SV)0.34±0.01 0.33±0.02c 0.44±0.05ab Group Normal group Control group Experimental group Number 10 10 9 Cochlear duct area(SM mm2)18.86±0.03 19.69±0.31 23.74±1.60 Cochlea duct plus vestibular terrace area(SM+SV mm2)56.61±2.13 55.97±2.08 49.68±3.48

我們參照苑述剛等[8]建立膜迷路積水豚鼠模型的給藥劑量及時間來復(fù)制到SD大鼠，成功誘導(dǎo)大鼠膜迷路積水，大鼠相對于豚鼠研究起來比較經(jīng)濟(jì)、操作簡便，研究方便。實驗中，我們從大鼠日常行為的表現(xiàn)定性評價，實驗組大鼠逐漸出現(xiàn)了自發(fā)活動的減少、聽覺不靈敏、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀，為明確大鼠的聽力學(xué)變化，本實驗對各組大鼠行ABR檢測，結(jié)果顯示實驗組大鼠與正常組和對照組相比Ⅱ波閾值明顯升高，且Ⅱ波、Ⅴ波的潛伏期，以及Ⅲ-Ⅴ波間期明顯延長，符合梅尼埃病的聽力改變的臨床表現(xiàn)。從微觀角度去分析，本實驗耳蝸HE染色顯示實驗組蝸管出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，前庭膜凸向前庭階或前庭膜斷裂，符合膜迷路積水的病理改變，而正常組及對照組無上述形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。此外，本研究統(tǒng)計結(jié)果顯示蝸管橫截面積與蝸管加前庭階橫截面積的比值在實驗組與正常組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示膜迷路積水模型成功建立，進(jìn)一步證實上述比值可用于客觀評價膜迷路積水。

綜上所述，本研究以SD大鼠為研究對象，成功制備大鼠膜迷路積水模型，分別從大鼠日常行為變化、ABR檢測、耳蝸切片的HE染色、耳蝸蝸管橫截面積（SM）與蝸管加前庭階橫截面積（SM+SV）的比值四方面定性及定量的去評價是否造模成功，此方法操作簡單、成模時間較快、對機體無破壞性、重現(xiàn)性好、成功率高等優(yōu)點。此研究為以后通過膜迷路積水的大鼠模型來探討梅尼埃病奠定了動物實驗基礎(chǔ)。本實驗研究也存在一定不足之處，由于本研究樣本量小，大鼠DDAVP給藥劑量和給藥時間與造模成功率的關(guān)系及如何進(jìn)一步提高大鼠建模成功率有待進(jìn)一步研究，本實驗只是從日常行為表現(xiàn)的變化上評價前庭功能有無異常，如果能給大鼠行前庭功能檢查（游泳實驗等），從定性定量角度去評價實驗會更完善。