天麻素對前庭功能障礙大鼠前庭內側核組胺受體表達的影響

姜宇晴張琦張業慧高梅傲冷輝*

1遼寧中醫藥大學(沈陽 110847)

2遼寧中醫藥大學附屬醫院(沈陽 110032）

人體平衡由前庭系統、本體感覺系統和視覺系統共同維持，與中樞神經系統密切聯系，而前庭系統起主導作用。前庭功能障礙發病率高、臨床癥狀嚴重，約有35%[1]成人患有需要治療的前庭功能障礙。前庭代償機制的研究對于促進中樞神經系統前庭功能的恢復和了解損傷后的功能可塑性具有重要意義。其中藥物治療方案目前尚無統一標準，且鮮有中藥單體治療此病者。

天麻素為天麻的主要成分之一，化學名稱為4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖甙，具有鎮靜、神經保護、改善微循環等作用[2]；可透過血腦屏障直接作用于中樞神經系統[3]。在天麻的代謝機制研究進展中發現其可平衡大腦皮層的興奮與抑制過程，用于眩暈病的治療[4]。因此，天麻素的促進前庭代償作用及機制的研究是耳科學前庭康復領域的一項重要課題。

本研究通過UL誘導前庭功能障礙大鼠模型，然后給予不同劑量的天麻素干預，通過檢測大鼠MVN中組胺H1、H2、H3受體基因和蛋白表達水平的變化，探討天麻素對前庭功能障礙大鼠的干預作用及機制，為天麻素應用于前庭功能障礙疾病提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠99只，體重180g～230g，雌雄不限，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。動物購入后，飼養于SPF級動物飼養室內，適應性飼養一周后用于正式實驗。

1.2 實驗藥品及試劑

天麻素（國藥準字：H20013046），昆明制藥集團股份有限公司生產；氯仿（批號：T20110801），國藥集團化學試劑有限公司生產；DAB試劑盒（AR1022），武漢博士德公司生產；BeyoECL star（P0018AS）、Western及IP細胞裂解液（P0013），廣州碧云天公司生產；HRH1 Polyclonal Antibody（PA5-18680），Thermo Fisher公司生產；Rabbit Anti-HRH2(bs-6664R)、Rabbit anti GAPDH（bs-1090 OR），北京博奧森生物技術有限公司生產；Anti-HRH3/H3R(ab236952)、HRP Goat Anti Rabbit（ab6721），Abcam公司生產。

1.3 儀器設備

全自動酶標儀（anthos 2010型），奧地利Anthos Labtec Instruments；恒溫水浴振蕩器（SHA-B型），常州國華電器有限公司；電泳儀（EPS300型）、凝膠成像分析系統（SF4200型），上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀（A25619CN），賽默飛世爾科技公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

將99只健康SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組（n=9）、假手術組（n=18）、造模組（n=72）。模型復制成功后，將造模組大鼠隨機分為4組：模型對照組（n=18）、天麻素高劑量組（n=18）、天麻素中劑量組（n=18）、天麻素低劑量組（n=18）。

2.2 造模方法

空白對照組正常飼養，造模組左側鼓室內注射氯仿（50%）0.1-0.2ml/耳，假手術組則注射生理鹽水[5]。術后0.5h，觀察大鼠行為學特征及失衡行為，進行模型評價。

2.3 模型評價

2.3.1 行為學特征及失衡行為評分

UL后造模組大鼠出現單側前庭外周感受器損毀的行為學表現特征：自發性眼震，一側傾倒、頭身偏斜等失衡行為。參考Petrosini報告的方法[6]對頭偏、軀干卷曲、肢體外展、強迫環形運動和眼震樣頭震等5個失衡癥狀分別評分，癥狀最嚴重記2分，癥狀消失記0分，總分在0-10分之間。在術后0.5h時間點對六組大鼠進行失衡行為的評分及頭偏斜測量。

2.3.2 空間姿勢反射

將大鼠置于海綿墊上約50cm的高度，呈仰臥位，使其自由下落，觀察下落過程：陰性表現為四肢著地，俯臥在海綿墊上。當出現身體一側或背部著地則視為陽性表現。

2.3.3 自發性眼震檢測

將大鼠兩眼外眥部和頭頂部充分脫毛后，將導電膏置于Ag-AgCl盤狀電極中并貼于兩眼外眥部，參考電極置于頭頂部，使用日本光電株式會生產的記錄系統在暗室記錄大鼠術后0.5、4、12、24、48h等幾個時間點自發性眼震頻率變化過程。

2.4 干預方法

空白對照組：正常飼養，不作處理。

假手術組、模型對照組：術后1h，大鼠肌注生理鹽水（75mg·kg-1·d-1），日1次，連續3天。

天麻素高、中、低劑量組：術后1h，大鼠分別肌注天麻素注射液（100 mg·kg-1·d-1）、（75mg·kg-1·d-1）、（50 mg·kg-1·d-1），日1次，連續3天。

2.5 樣本采集

給藥至第3天，末次給藥后1h，空白對照組隨機抽取3只，其余各組中隨機抽取6只，過量麻醉法處死大鼠，取全腦組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，室溫固定，用于免疫組織化學法檢測。

剩余大鼠過量麻醉法處死，取全腦置于冰面上，空白對照組分離雙側MVN組織，其余組分離左側MVN組織，所有MVN 2等分，一份直接凍存于-80℃冰箱中，用于Western-Blot檢測；另一份加入0.5mlTrizol再凍存，用于RT-PCR檢測。

2.6 指標檢測

2.6.1 免疫組化法檢測各組大鼠MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達水平

常規制備石蠟切片，脫蠟并水化，檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復20分鐘，滴加正常山羊血清封閉10min，傾去封閉液，勿洗。加一抗（1:300稀釋）4℃孵育過夜。次日復溫1h，洗片后加二抗工作液，37℃孵育60min，PBS洗滌，5次×5min，DAB顯色3min，自來水沖洗，蘇木素復染30s-1min，1%鹽酸乙醇分化10-30s，自來水沖洗。中性樹膠封片，數碼顯微鏡下觀察并采集照片,采用生物信號采集系統測定平均光密度值作為該例樣本目的蛋白相對表達水平進行統計分析。

2.6.2 RT-PCR法檢測各組大鼠MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達水平

Trizol裂解法提取組織中總RNA，測定濃度及質量后，采用一步法RT-PCR試劑盒檢測組胺受體H1、H2、H3 mRNA的表達水平。引物序列詳見表1。經ABI Prism 7500 HT序列檢測系統檢測出CT值，△CT=CT目的基因-CT內參,△△CT=△CT實驗-△CT對照,根據計算公式：△△CT值＝（靶基因CT值-內參CT值）處理組-（靶基因CT值-內參CT值）未處理組，用2-ΔΔCT表示靶基因的表達相對于內參基因的改變倍數，即相對表達量，并進行統計分析,詳見表1。

2.6.3 Western-Blot法檢測各組大鼠MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達水平

裂解法提取總蛋白，蛋白定量后變性，50ug蛋白量進行垂直電泳，濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜，將PVDF膜以5%BSA溫室封閉1h，然后一抗（稀釋度為1:300）4℃孵育過夜。次日取出復溫1h，去除抗體，TBST洗膜6次×5min。HRP標記的二抗（稀釋度為1:2000）37℃孵育2h，去除二抗，洗膜6次，ECL發光并采集照片，測定目的蛋白條帶和內參條帶的灰度值，并以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平，進行統計分析。

3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，以均數±標準差（）表示，以P＜0.05為有統計學差異。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

4 結果

4.1 模型評價

4.1.1 一般狀態觀察

造模組大鼠在術后麻醉清醒后，出現明確的前庭功能損傷的失衡行為。假手術組無相關癥狀出現。如圖1，表2。

4.1.2 空間姿勢反射

空白對照組和假手術組空間姿態反射均為陰性；而其余四組空間姿態反射均為陽性。

4.1.3 自發性眼震檢測

記錄大鼠術后0、4、12、24、48h等幾個時間點自發性眼震頻率變化過程，可見高劑量天麻素降低自發性眼震頻率效果最佳。詳見表3。

4.2 免疫組化法檢測MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達

與空白對照組（0.115±0.023、0.104±0.017、0.108±0.012）和假手術組（0.110±0.017、0.111±0.010、0.118±0.016）比較，其余各組大鼠MVN中H1、H2、H3的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與模型對照組（0.167±0.006、0.174±0.014、0.181±0.011）比較，天麻素高劑量組（0.271±0.008、0.266±0.024、0.263±0.018）大鼠MVN組胺受體H1、H2、H3的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與天麻素中（0.219±0.010、0.213±0.019、0.213±0.025）、低（0.183±0.004、0.194±0.031、0.188±0.010）劑量組比較，天麻素高劑量組MVN組胺受體H1、H2、H3的表達水平顯著上調（P＜0.01），差異均有統計學意義。詳見表4，圖2～4。

表2 失衡癥狀評分及頭偏角模型評價（±s）Table 2 Evaluation of imbalance symptom score and head deflection angle model（±s）

表2 失衡癥狀評分及頭偏角模型評價（±s）Table 2 Evaluation of imbalance symptom score and head deflection angle model（±s）

Notes:n總=99.*P＜0.05,**P＜0.01,Comparison with blank control group;#P＜0.05,##P＜0.01,Comparison with sham operation group.

Group Blank control group Sham operation group Model control group Gastrodin high dose group Gastrodin middle dose group Gastrodin low dose group n9 1 8 18 18 18 18 Imbalance score（score）0.00±0.00 0.00±0.00 7.83±0.75**##7.83±0.75**##7.67±1.03**##7.33±1.63**##Head deflection angle（degree）0.00±0.00 0.00±0.00 40.17±3.65**##36.83±3.43**##42.50±4.42**##41.00±5.18**##

表3 各組不同時間點自發性眼震頻率（Hz）Table 3 Frequency of spontaneous nystagmus at different time points in each group（Hz）

表4 各組MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達（±s）Table 4 Expression of histamine receptor subtypes H1,H2,H3 in MⅤN of each group（±s）

表4 各組MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達（±s）Table 4 Expression of histamine receptor subtypes H1,H2,H3 in MⅤN of each group（±s）

Notes:n總=33.*P＜0.05,**P＜0.01,Comparison with blank control group;#P＜0.05,##P＜0.01,Comparison with sham operation group;△P＜0.05,△△P＜0.01,Comparison with model control group;○P＜0.05,○○P＜0.01,Comparison with high dose gastrodin group;☆P＜0.05,☆☆P＜0.01,Comparison with middle dose gastrodin group.

Group Blank control group Sham operation group Model control group Gastrodin high dose group Gastrodin middle dose group Gastrodin low dose group n3 6 6 6 6 6 H1 0.115±0.023 0.110±0.017 0.167±0.006**##0.271±0.008**##△△0.219±0.010**##△△○○0.183±0.004**##△○○☆☆H2 0.104±0.017 0.111±0.010 0.174±0.014**##0.266±0.024**##△△0.213±0.019**##△△○○0.194±0.031**##○○H3 0.108±0.012 0.118±0.016 0.181±0.011**##0.263±0.018**##△△0.213±0.025**##△△○○0.188±0.010**##○○☆

4.3 PCR法檢測MVN中組胺受體H1、H2、H3 mRNA表達水平

與空白對照組（1.003±0.085、1.002±0.072、1.005±0.118）和假手術組（0.993±0.032、1.005±0.060、1.008±0.039）比較，其余各組大鼠MVN中H1、H2、H3 mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與 模 型 對 照 組（1.315± 0.078、1.418± 0.094、1.467±0.083）比較，天麻素高劑量組（3.392±0.197、3.553±0.189、3.657±0.077）大鼠MVN中組胺受體H1、H2、H3 mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與天麻素中（2.708±0.143、2.783±0.113、2.828±0.055）、低（2.330±0.158、2.293±0.118、2.292±0.084）劑量組比較，天麻素高劑量組MVN中組胺受體H1、H2、H3 mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.01），差異均有統計學意義。詳見表5。

4.4 Western-Blot法檢測MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型的表達水平

與空白對照組（0.282±0.026、0.250±0.050、0.248±0.016）和假手術組（0.267±0.045、0.261±0.026、0.284±0.042）比較，其余各組大鼠MVN中H1、H2、H3的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與模型對照組（0.408±0.056、0.453±0.031、0.403±0.057）比較，天麻素高劑量組（0.571±0.034、0.572±0.078、0.600±0.061）大鼠 MVN 中組胺受體 H1、H2、H3的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與天麻素中（0.462±0.039、0.483±0.053、0.479±0.062）、低（0.441±0.062、0.480±0.033、0.461±0.024）劑量組比較，天麻素高劑量組MVN中組胺受體H1、H2、H3的表達水平上調（P＜0.05），差異均有統計學意義。詳見圖5。

圖1 大鼠的繞圈行為Fig.1 Circled behavior of rats

圖2 各組大鼠MVN中H1表達Fig.2 Expression of H1 in MⅤN of rats in each group

表5 各組MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型mRNA表達（±s）Table 5 Expression of histamine receptor H1,H2,H3 mRNA in MⅤN of each group（±s）

表5 各組MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型mRNA表達（±s）Table 5 Expression of histamine receptor H1,H2,H3 mRNA in MⅤN of each group（±s）

Notes:n總=66.*P＜0.05,**P＜0.01,Comparison with blank control group;#P＜0.05,##P＜0.01,Comparison with sham operation group;△P＜0.05,△△P＜0.01,Comparison with model control group;○P＜0.05,○○P＜0.01,Comparison with high dose gastrodin group;☆P＜0.05,☆☆P＜0.01,Comparison with middle dose gastro?din group.

Group Blank control group Sham operation group Model control group Gastrodin middle dose group Gastrodin middle dose group Gastrodin low dose group n 6 1 2 12 12 12 12 H1 1.003±0.085 0.993±0.032 3.392±0.197**##△△2.708±0.143**##△△○○2.708±0.143**##△△○○2.330±0.158**##△△○○☆☆H2 1.002±0.072 1.005±0.060 3.553±0.189**##△△2.783±0.113*##△△○○2.783±0.113*##△△○○2.293±0.118**##△△○○☆☆H3 1.005±0.118 1.008±0.039 3.657±0.077**##△△2.828±0.055**##△△○○2.828±0.055**##△△○○2.292±0.084**##△△○○☆☆

圖3 各組大鼠MVN中H2表達Fig.3 Expression of H2 in MⅤN of rats in each group

圖4 各組大鼠MⅤN中H3表達Fig.4 Expression of H3 in MⅤN of rats in each group

圖5 第3天各組MVN中組胺受體H1、H2、H3的表達水平及柱形圖注：n總=66. *P＜0.05，**P＜0.01,與空白對照組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與假手術組比較。Fig.5 On the third day,histamine receptors H1,H2,H3 in MⅤN of each group Expression level and column chartNotes:n總=66.*P＜0.05,**P＜0.01,Comparison with blank control group;#P＜0.05,##P＜0.01,Comparison with sham operation group.

5 討論

前庭代償是一種中樞過程，其中前庭內側核的作用尤為關鍵[8]。前庭系統的平衡功能是通過前庭外周終末器與前庭中樞共同實現。UL后，前庭外周終末器的信號傳入永久性喪失，因此前庭代償一定發生在中樞傳導通路中[9]；目前的行為學和電生理研究結果顯示,損傷側的MVN神經細胞的靜息電位活性由高轉低，而對側的神經細胞活動度正常或增高[10]。雙側MVN電位的不平衡是引起眼動和姿勢不對稱的根本原因[11]。前庭中樞系統通過自身強大的再平衡功能，使得上述癥狀在短時間內逐漸緩解得到改善，這一過程即為前庭代償，與中樞系統有關，至今機制仍未完全明確。本實驗采用UL復制前庭功能障礙大鼠模型。術后大鼠空間姿勢反射結果表明造模成功，麻醉蘇醒后出現失平衡表現，提示UL后MVN神經元因受損的初級前庭傳入神經失去興奮性表現出低活性。

中樞系統含有大量的神經遞質，而組胺作為重要的中樞神經遞質，參與前庭功能的調控[12]。組胺通過與其特異性受體相結合使細胞興奮性改變產生不同的生物學效應，其受體分為H1～H4亞型，均為G蛋白偶聯受體家族[13]。報道顯示，組胺H1受體大量存在于MVN，介導組胺對前庭核的突觸后興奮作用[14]，組胺H1受體在MVN中激活導致神經元的去極化和興奮，在前庭代償中起到促進作用[15]。組胺H2受體同H1亞型均為突觸后受體，表達于外周前庭終末器及前庭核團中，與前庭神經細胞興奮性相關[16]；組胺H3受體是一個突觸前受體并且能下調組胺能末梢組胺的合成和釋放[17]。Lozada[18]表明H3受體參與突觸前機制導致同側前庭核神經元靜息活動正常化，與組胺釋放的負反饋調節機制相關。H3受體拮抗劑倍他司汀通過阻斷突觸前H3受體并誘導H3受體下調，增加組胺的周轉和釋放[19]。H2受體拮抗劑或H3受體激動劑阻斷組胺能神經遞質的傳遞引發了與UL后類似的平衡失調癥狀[20]；組胺H4受體與H3亞型受體同源性較高，傾向與Gi/o蛋白偶聯，調節過敏和炎癥反應，但機制尚不清楚[18,21]。因此，在前庭神經元電位維穩的既需要H1、H2受體激活后興奮性作用，也離不開H3受體抑制性作用的存在。因此組胺H1、H2、H3受體均參與前庭代償過程且具有調控作用。

近年來，研究發現天麻素對于治療眩暈癥有良好的療效[22]。它具有獨特的優勢，與前庭鎮靜藥不同的是，前庭鎮靜藥用于緩解癥狀通常會妨礙恢復前庭功能[23]，但天麻素旨在促進中樞前庭代償。曹麗萍[24]在天麻素治療眩暈癥臨床療效的meta分析中指出天麻素療效顯著優于目前眩暈常用藥物。本研究發現，UL誘導的前庭功能障礙大鼠MVN中組胺受體H1、H2、H3亞型均有表達，較正常大鼠顯著升高，提示組胺受體H1、H2、H3亞型的過表達在前庭功能障礙發病過程中發揮了重要作用[25]。而天麻素對自發性眼震頻率的有效調控也說明了其促代償作用，并且天麻素促進H1、H2、H3受體基因及蛋白的表達，提示天麻素促代償作用可能通過上調組胺受體表達實現，而不同劑量天麻素呈現劑量依賴關系。這些發現不僅為損傷后中樞神經回路的可塑性和功能恢復提供了新的見解，而且有望成為前庭功能障礙的一種新的潛在治療靶點。

綜上所述，天麻素上調MVN組胺受體H1、H2、H3、mRNA及蛋白表達水平可能是為今后臨床防治前庭功能障礙及促進前庭代償提供新方向。