巨細胞病毒感染耳蝸上皮細胞差異表達的miRNA篩選及驗證

李俎怡何蓉

1中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科（沈陽 110001）

2珠海市婦幼保健院檢驗科（遺傳研究所）（珠海 519000）

耳聾是影響人類健康和致殘的常見疾病，據(jù)統(tǒng)計平均每1000個新生兒中就有1-3個耳聾患者[1,2]。耳聾可以由基因突變引起，也可由環(huán)境因素（如細菌感染、病毒感染、聲損傷等）或基因和環(huán)境互相作用引起[3]。其中50%的耳聾被認為與環(huán)境因素有關(guān)[4]。研究表明，兒童的中、重度耳聾30%與先天性巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染有關(guān)[5]。巨細胞病毒，是一種具有雙鏈DNA的皰疹病毒，屬于皰疹病毒B亞科，且具有種屬特異性。CMV感染在人群中普遍存在，新生兒出生時感染率達0.2%—0.3%[6]。先天性CMV感染已被證實是嬰幼兒非遺傳性感音神經(jīng)性聾（Sensorineural hearing loss，SNHL）的最主要原因。大多數(shù)情況下的SNHL發(fā)生伴有耳蝸感覺毛細胞和神經(jīng)結(jié)構(gòu)受損。CMV感染內(nèi)耳有多種途徑，傳染性病原體既可以通過與耳蝸外淋巴隔室相鄰的大腦腦室儲液池進入內(nèi)耳，也可以通過圓形窗口和血液途徑進入耳蝸。以前的研究表明，外周（腹膜內(nèi)）接種CMV也可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)和耳蝸感染[7]。CMV感染內(nèi)耳的多種途徑為研究CMV致聾建立動物模型提供了方法。目前，最常用于耳毒性研究的細胞模型是源自ImmortomouseTM內(nèi)耳的OC-k3細胞系。OC-k3細胞不表達神經(jīng)元標記，因此它們是毛細胞的假定前體細胞[8]。選擇CMV感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞（OC-k3細胞系）模型具有一定技術(shù)優(yōu)勢，其原代細胞的生物性狀不會發(fā)生很大的改變，這一定程度上反映了它們在體內(nèi)的狀態(tài)，表現(xiàn)出原組織或細胞的特性。且原代細胞的基因表達分析能使研究者更好的理解生物學通路和疾病進程。

近年來，隨著高通量測序及生物信息技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得研究microRNA在聽覺系統(tǒng)的發(fā)育和功能中的作用已經(jīng)成為一個研究領(lǐng)域的熱點。微小RNA（microRNA,miRNA）是小的非編碼RNA，其通過RNA干擾（RNAi）途徑發(fā)揮功能，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)真核生物中的基因表達。miRNA在哺乳動物的內(nèi)耳中表達豐富，并且某些miRNA在進化上與感覺細胞的發(fā)育和功能相關(guān)，miRNAs是內(nèi)耳胚胎發(fā)育和出生后毛細胞命運維持所必需的[9]。自從1993年被發(fā)現(xiàn)以來，已鑒定出許多在內(nèi)耳和外耳的正常發(fā)育中起作用的miRNA[10]。盡管已知miRNA影響細胞增殖，分化和形態(tài)發(fā)育，但尚未對其表達或在哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育中的作用進行論述。本研究擬通過篩選巨細胞病毒感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞和正常小鼠耳蝸感覺上皮細胞差異表達的miRNA，以探索miRNA在mCMV感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞中的作用及其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系，病毒，及主要試劑

小鼠巨細胞病毒（mouse Cytomegalovirus，mCMV）Smith株來自中國醫(yī)科大學病毒研究所，小鼠耳蝸上皮細胞（Mouse cochlear epithelial cells，MCEC）oc-k3細胞系購自于上海撫生生物技術(shù)有限公司。DEMD高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS等購自以色列BI公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，miRNA First-strand cDNA Synthesis，SuperMix Top qPCR SuperMix等miRNA反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自中國全式金生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及病毒感染小鼠耳蝸上皮細胞模型的建立

MCEC細胞培養(yǎng)至能夠穩(wěn)定傳代的細胞系L10代左右，將細胞鋪于25CM2細胞培養(yǎng)瓶中，待其長滿單層后，進行細胞饑餓12h，以使細胞同步化。以MOI=1接種小鼠巨細胞病毒，37℃孵育90分鐘后，添加含2%FBS的MECE培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h，同步設(shè)置未接毒的MCEC細胞為對照組，并將實驗組與對照組各進行三次生物學重復，于72h在普通光學顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察細胞病毒感染情況并記錄。

1.3 總RNA的提取

將感染以及未感染72h的細胞樣品用Trizol進行裂解，經(jīng)過氯仿抽提，異丙醇沉淀，乙醇洗滌沉淀等過程對細胞總RNA進行提取，用分光光度計測量RNA的濃度，并用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存。

1.4 RNA小文庫的構(gòu)建及高通量測序

將經(jīng)Trizol處理的感染72h（實驗組）和未感染72h(對照組)的細胞樣品，交由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成小RNA文庫構(gòu)建及高通量測序，檢測病毒感染組及對照組miRNA表達的變化。

1.5 熒光定量PCR驗證高通量測序結(jié)果

篩選差異表達明顯的miRNA驗證,篩選標準：根據(jù)測序結(jié)果，挑選差異表達倍數(shù)FC＞10,P＜0.01,已知和新發(fā)現(xiàn)的miRNA中上調(diào)最明顯的miRNA各6個；差異表達倍數(shù)FC＞2,P＜0.01,已知和新發(fā)現(xiàn)的miRNA中下調(diào)最明顯的miRNA各2個，進行驗證。采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對1.3中提取的細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，得到的cDNA用作熒光定量PCR的模板，選用RNU6基因作為內(nèi)參，引物序列見表1，使用相對定量方法驗證，計算結(jié)果基于2-△△ct法，所有實驗進行三次生物學重復。

表1 miRNA實時熒光定量PCR引物序列Table 1 miRNA qPCR primer sequences

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。兩組數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布計量資料，采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney Test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。用GraphPadPrism軟件進行畫圖。

1.7 差異miRNA靶基因功能富集分析

我們基于miRNA和基因(mRNA)表達差異結(jié)果進行聯(lián)合分析。對預測得到的miRNA的靶基因進行GO和KEGG富集分析，研究miRNA對于基因表達以及他在生物學進程的調(diào)控作用，同時還能對新預測的miRNA的調(diào)控功能做研究。

2 結(jié)果

2.1 mCMV感染與未感染72h的小鼠耳蝸上皮細胞

小鼠巨細胞病毒Smith株帶有GFP-綠色熒光蛋白標簽，可在熒光顯微鏡下觀察其在細胞中的感染情況，見圖1。mCMV感染72h時，處于病毒增長的指數(shù)期，此時細胞內(nèi)病毒復制活躍細胞感染率較高。

圖1 A為實驗組mCMV感染小鼠耳蝸上皮細胞72h熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；B為mCMV感染小鼠耳蝸上皮細胞72h光學相差顯微鏡下觀察結(jié)果，可見受感染的細胞變大，聚集，脫落、融合甚至損傷、死亡等出現(xiàn)細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)；C為對照組未感染的小鼠耳蝸上皮細胞72h相差顯微鏡下觀察結(jié)果，細胞生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細胞病變效應。Fig.1 A shows the observation results of the cochlear epithelial cells of mice infected with mCMⅤin the experimental group under a 72h fluorescence microscope.B shows the observation results of the cochlear epithelial cells of mice with mCMⅤinfection in a 72h optical phase contrast microscope.Cytopathic effect(CPE)even appeared in injury and death.C is the observation result of 72h phase contrast microscope of uninfected mouse cochlear epithelial cells in control group,the cell growth was good,and no cytopathic effect appeared.

2.2 miRNA差異表達譜

根據(jù)小RNA文庫測序比對結(jié)果，對感染及未感染mCMV 72h的小鼠耳蝸感覺上皮細胞差異表達的miRNA進行分析,篩選樣本間差異表達的miRNA，采用顯著性P值（P-value）和差異倍數(shù)（fold-Change，F(xiàn)C）作為差異表達的判斷標準：（1）當P≤0.05，且FC≥2（log2(FC)≥ 1），判斷為上調(diào)Upregulate；（2）當P≤ 0.05，且 FC≤0.5（log2(FC)≤ -1），判斷為下調(diào)Down-regulate。其結(jié)果如圖2所示，共檢測到143個差異表達的miRNA，其中已知的miRNA有81個，新發(fā)現(xiàn)的miRNA有62個。已知的miRNA中共檢測到69個上調(diào)的miRNA,12個下調(diào)的miRNA；新發(fā)現(xiàn)的miRNA中，共檢測到46個上調(diào)的miRNA,16個下調(diào)的miRNA。

圖2 顯著性差異表達miRNA的火山分布圖。A為已知差異表達的miRNA的火山分布圖；B圖為新發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA的火山分布圖；圖中每一個點代表一個miRNA，橫坐標為fold-change值，縱坐標為顯著性P-Value。紅色標記為上調(diào)Up的miRNA，綠色標記為下調(diào)Down的miRNA。Fig.2 Ⅴolcanic distribution of significantly differently expressed miRNAs.A is the volcanic distribution of known differentially expressed miRNAs.B is the volcanic distribution of newly discovered differentially expressed miRNAs.Each point in the figure represents a miRNA,the abscissa is the fold-change value,and the ordinate is the significant P-Ⅴalue.Red marks are up-regulated miRNAs,and green marks are down-regulated miRNAs.

2.3 篩選差異表達顯著的miRNA

篩選標準：測序結(jié)果中差異表達倍數(shù)FC＞10,P＜0.01,TOP6已知和新增上調(diào)的miRNA；測序結(jié)果中差異表達倍數(shù)FC＞2,P＜0.01,TOP2的已知和新增下調(diào)的miRNA，見表2。

2.4 qPCR驗證差異表達明顯的miRNA

對測序得到的差異表達的miRNA,我們對篩選差異表達明顯的進行驗證。qPCR結(jié)果顯示，RNU6及miRNA產(chǎn)物熔解曲線均為單一曲線,反應特異。mCMV感染MCEC 72h后，驗證8個已知的miRNA中，有6個與測序結(jié)果趨勢一致，其中5個為上調(diào)，1個為下調(diào)趨勢，見圖3（A）；驗證8個新發(fā)現(xiàn)的miRNA中，有4個與測序結(jié)果趨勢一致，全部為上調(diào)趨勢的miRNA，見圖3（B）。miRNA的測序結(jié)果與qPCR結(jié)果趨勢基本一致。表明，在mCMV感染MCEC過程中miRNA確實發(fā)生了差異表達，其中miR-7b-5p，miR-7a-5p的差異十分顯著，上調(diào)約6倍左右，見表3,4，他們在病毒感染細胞的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

圖3 差異表達的miRNA熒光定量PCR結(jié)果。A為差異表達的已知miRNA qPCR驗證結(jié)果；B為差異表達的新發(fā)現(xiàn)miRNA qPCR驗證結(jié)果；柱狀圖中每柱子代表經(jīng)不同處理組處理的miRNA，黑色柱為病毒感染組的miRNA。灰色柱為對照組的miRNA。橫坐標為miRNA的名稱，縱坐標為miRNA相對表達量。n=3，*P＜0.05。Fig.3 Quantitative PCR results of differentially expressed miRNAs.A is the differentially expressed known miRNA qPCR verification results.B is the differentially expressed new miRNA qPCR verification results.Each bar in the histogram represents the miRNA treated by a different treatment group,black bars are miRNAs from the virus-infected group,the gray bar is the miRNA of the control group.The abscissa is the name of the miRNA and the ordinate is the miRNA relative Expression.n=3,*P＜0.05.

表2 篩選差異表達明顯的miRNATable 2 Screen for differentially expressed miRNAs

2.5 差異表達miRNA靶基因的富集分析

為了解這些差異表達miRNA的功能，我們對測序結(jié)果得到的差異表達的miRNA靶基因進行功能富集分析。如圖4所示，圖中按富集程度列出最靠前的三十個分類項，分析顯示：多數(shù)差異性表達的miRNA的功能主要參與細胞、生物過程的調(diào)控，新陳代謝的調(diào)控，以DNA為模板轉(zhuǎn)錄，RNA合成等生物學過程；主要作為細胞內(nèi)，核質(zhì)等細胞成分；主要行使離子結(jié)合等分子功能。通過KEGG分析，如圖5所示:這些差異miRNA主要參與了感覺系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)，病毒傳染，信號轉(zhuǎn)導等的信號通路。

圖4 miRNA靶基因的GO富集圖。圖中橫坐標表示富集結(jié)果中注釋到該Term的輸入的差異基因數(shù)目與注釋到該Term的背景基因數(shù)目的比值，該比值越大表示富集程度越大。顏色代表Corrected P-Value/P-Value，該值越小表示該條term富集越可靠。圈的大小代表富集結(jié)果中的注釋到該Term的輸入的差異基因數(shù)目，其值越大，圈越大。Fig.4 GO enrichment map of miRNA target genes.The abscissa in the figure represents the ratio of the number of differential genes annotated to the Term input to the number of background genes annotated to the Term in the enrichment result.The larger the ratio,the greater the degree of enrichment.The color represents Corrected P-Ⅴalue/P-Ⅴalue.The smaller the value is,the more reliable the term enrichment is.The size of the circle represents the number of differential genes from the annotation in the enrichment result to the input of the Term.The larger the value,the larger the circle.

表3 熒光定量PCR驗證實驗組和對照組中已知miRNA相對表達量Table 3 Relative expression levels of know miRNA in the experimental group and the control group by qPCR

表4 熒光定量PCR驗證實驗組和對照組新發(fā)現(xiàn)的miRNA相對表達量Table 4 Relative expression levels of novel miRNA in the experimental group and the control group by qPCR

圖5 miRNA靶基因的KEGG分類圖。圖中橫坐標為所富集到的lncRNA靶基因數(shù)目，縱坐標為基因功能分類條目，每一種顏色代表不同的分類類別。Fig.5 KEGG classification of miRNA target genes.In the figure,the abscissa is the number of lncRNA target genes that are enriched,and the ordinate is the gene function classification entry.Each color represents a different classification category.

3 討論

miRNA是一類內(nèi)源性18-24核苷酸（nt）非編碼RNA，它們具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能。大量的研究表明，miRNA參與多種生理過程，包括發(fā)育，細胞凋亡和脂肪代謝的調(diào)節(jié)。它們也被證明與腫瘤和病毒感染的建立和發(fā)展相關(guān)[11-13]。

在本研究中，我們首先構(gòu)建mCMV感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞的模型，用高通量測序技術(shù)來檢測mCMV感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞后，處于病毒指數(shù)增長期72小時時miRNA變化的情況，通過測序發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA，進而通過對測序結(jié)果進行篩選，用qPCR驗證得到與測序結(jié)果趨勢一致的6個已知miRNA，4個新發(fā)現(xiàn)的miRNA。

經(jīng)qPCR驗證，與測序結(jié)果趨勢一致的10個miRNA中，miR-7b-5p和miR-7a-5p的差異表達較為明顯，他們在病毒感染細胞的過程中可能發(fā)揮著重要的作用，值得深入研究。利用miRanda軟件對這兩個miRNA進行miRNA-Target預測,其中miR-7b-5p 的靶基因 Plpp5，Tcf12，S1pr2，Atrx，Shpk，Luc7l等得分較高，miR-7a-5p的靶基因Cbx4，Shpk，Plpp5，2210011C24Rik等得分較高。通過對他們的靶基因進行GO功能顯著性富集分析，結(jié)果顯示，這兩個miRNA在生物學功能上主要參與代謝過程，細胞過程，生物調(diào)節(jié)過程，以及對刺激的反應。在細胞成分上主要是構(gòu)成膜，大分子復合物，細胞器部分等。在分子功能上主要行使核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，分子換能器活性，催化活性等分子功能。在KEGG信號通路分析中，發(fā)現(xiàn)這些miRNA的靶基因主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用，鞘脂信號通路，氧化應激誘導衰老，細胞對壓力的反應等信號通路。以往研究表明,CMV誘發(fā)SNHL與耳蝸細胞炎癥反應有關(guān)，CMV感染可引起炎癥小體在小鼠內(nèi)耳組裝，這些炎性因子具有神經(jīng)毒性，可能會導致聽力受損[14]。而本研究中發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA靶基因也與免疫系統(tǒng)的信號通路有關(guān)。此外又有研究表明，由MCMV感染引起的聽力下降可能與活性氧ROS引起的炎癥有關(guān)，MCMV可通過在小鼠耳蝸和培養(yǎng)的SGN中產(chǎn)生ROS來激活NLRP3炎性體[15]，而本研究中對經(jīng)qPCR驗證的兩個差異表達明顯的miRNA靶基因功能富集分析中顯示他們參與氧化應激誘導衰老的信號通路。從而可以推測這些差異表達的miRNA可以通過免疫反應，氧化應激等相關(guān)通路在CMV致聾的過程中發(fā)揮出重要的作用。由此可見，這些差異表達的miRNA在巨細胞病毒感染小鼠耳蝸感覺上皮細胞中行使了十分重要的生物學功能。病毒與宿主之間以miRNA為介質(zhì)相互拮抗。病毒為了利于復制，而宿主細胞為了對抗病毒感染，他們利用miRNA作為調(diào)控分子相互協(xié)調(diào)，形成了一張復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控,信號轉(zhuǎn)導,過程凋亡等途徑中發(fā)揮了重要的作用。

高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展為非編碼RNA的系統(tǒng)研究提供了一個快速可靠的平臺。高通量測序技術(shù)具有高通量和低單堿基成本的特點,但是測序讀長相對較短是第二代測序技術(shù)的主要缺陷[16]。高通量測序技術(shù)同時也存在著分析質(zhì)量的把控，主要包括比對質(zhì)量、組裝質(zhì)量以及預測miRNA時產(chǎn)生的假陽性等問題。因此，我們通常需要對高通量測序的結(jié)果采用另一技術(shù)平臺實時熒光定量PCR技術(shù)進行驗證，由于高通量測序技術(shù)與實時熒光定量PCR技術(shù)是不同的技術(shù)平臺，測序也存在一定的錯誤率，隨著錯誤的積累，最終導致表達量出現(xiàn)一定程度的偏差。在本研究中，挑選驗證的miRNA存在一定比例的低表達，即測序結(jié)果表達量讀數(shù)值RawRC偏低，這在一定程度上會使驗證結(jié)果的總體吻合率降低，而從本次研究的結(jié)果來看，驗證結(jié)果的總體吻合率達到60%以上，基本可以確定測序結(jié)果的可靠性。盡管越來越多的學者通過高通量測序技術(shù)來研究非編碼RNA，但是轉(zhuǎn)錄組學的研究尚處在起步階段，特別對于miRNA的調(diào)控機制，仍然面臨著諸多問題與挑戰(zhàn)。但是隨著未來測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，miRNA在巨細胞病毒感染耳聾過程中的作用機制終將被人們所挖掘。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究應用高通量測序檢測出mCMV感染MECE72h時miRNA的差異表達，篩選并驗證出差異表達明顯的miRNA，利用生物信息學技術(shù)對差異表達的miRNA所具有的生物學功能以及可能參與的信號通路進行預測，從分子水平為探討CMV感染導致耳聾發(fā)生發(fā)展機制提供了新的研究方向，為近一步研究CMV感染導致耳聾的發(fā)生機制提供了有意義的信息。