年齡相關(guān)性聽力減退與NR3C1基因SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性分析

宋婉雪江海英譚坦任繼鋒汪照國王炳玲段海平,*

1青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)（青島 266000）

2山東省青島市城陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心(青島 266109)

3山東第一醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院公共衛(wèi)生專業(yè)（泰安 271000）

4山東省青島市疾病預(yù)防控制中心（青島 266011）

年齡相關(guān)性聽力減退(Age-related Hearing Impairment,ARHI)，又稱為老年性耳聾(Presbycusis)，是一種嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的感音神經(jīng)性耳聾[1]。它表現(xiàn)為隨個體年齡的增加而出現(xiàn)的雙耳對稱性、漸進(jìn)性聽力降低，首先是高頻聽力的下降，然后逐漸擴(kuò)展到中低頻率聽力水平，最后發(fā)展成為全頻聽力水平的降低[2]。患有ARHI后不僅會對老年人的正常交流產(chǎn)生障礙，而且會使得老年人對于報警聲等高頻率聲音不敏感，導(dǎo)致心理上孤獨(dú)感產(chǎn)生以及生活危險性增加[3]。隨著老年人口數(shù)逐漸增大，ARHI的患病情況不容樂觀，預(yù)計(jì)在2025-2040年間導(dǎo)致我國老年人聽力殘疾原因主要是由ARHI引起的[4]，可見研究與ARHI發(fā)生有關(guān)的因素具有重要的疾病預(yù)防和人群意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)ARHI與遺傳因素和環(huán)境因素均有關(guān)[5,6]。目前提及較多的非遺傳因素有環(huán)境噪聲、吸煙、過度飲酒、高血壓以及高血糖等[5,7,8]。還有多項(xiàng)研究顯示40%-50%ARHI發(fā)病是由遺傳因素所導(dǎo)致的[7,9]。以雙胞胎隊(duì)列和家庭隊(duì)列為研究對象的縱向研究表明，ARHI的遺傳度為25%-75%[10]。以往人類遺傳學(xué)研究已經(jīng)報道了許多ARHI相關(guān)基因，如 GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等[6,11,12]。然而，關(guān)于糖皮質(zhì)激素受體基因(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 1,NR3C1)與ARHI關(guān)系的研究很少。NR3C1基因在體內(nèi)可以編碼生成糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptor,GR）。人內(nèi)耳組織及實(shí)驗(yàn)動物研究表明GR主要分布于內(nèi)耳的螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋、Corti器中并且發(fā)揮著重要的生理作用[13]。

本研究旨在探討青島地區(qū)漢族老年人群中NR3C1基因與ARHI之間的關(guān)系，探究NR3C1基因的遺傳易感性。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

通過整群隨機(jī)抽樣方法抽取青島地區(qū)漢族非相關(guān)個體作為研究對象，本研究經(jīng)青島市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書并且自愿參與本項(xiàng)研究。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60歲的中老年人；（2）青島市常住漢族居民（＞5年）；（3）能很好的配合此次的所有調(diào)查項(xiàng)目。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有影響聽力的疾病史、暴露史及用藥史者；（2）無法配合完成問卷及各項(xiàng)檢查者。

1.2 問卷調(diào)查

使用統(tǒng)一的調(diào)查方法、調(diào)查表進(jìn)行調(diào)查，為了避免產(chǎn)生由于調(diào)查人員詢問方式方法產(chǎn)生的偏倚，在調(diào)查前對調(diào)查工作人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)。調(diào)查過程中選擇安靜的隔音房間、舒適的座椅、引導(dǎo)員維護(hù)秩序并對調(diào)查過程監(jiān)督、一對一的詢問等方法消除環(huán)境因素的影響。

問卷調(diào)查內(nèi)容主要包括：研究對象的基本情況、吸煙飲酒情況、飲食和運(yùn)動情況。研究對象基本情況包括：年齡、性別、DHI量表評分、是否對骨質(zhì)疏松了解、身高改變與否、是否服用抗骨質(zhì)疏松藥物、糖尿病、心血管疾病、慢性肝病、骨密度、BMI、腰圍、臀圍。吸煙和飲酒情況包括：吸煙頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、吸煙量（每天0根/6根及以下/7-12根/13-18根/19根及以上）、飲酒頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、飲酒量（每次0ml/50ml及以下/50-99ml/100-149ml/150ml及以上）、被動吸煙頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）。飲食和運(yùn)動情況包括：飲綠茶和紅茶頻率（每周＜1次/每周1-3次/每周4-6次/每天1次/每天2-3次/每天4次及以上）、食堅(jiān)果、油炸食品和牛奶的攝入頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、是否食用刺激性食物、是否每日蔬菜攝入、水果攝入（每周1-2次/3-4次/5-6次/7次及以上）、餐次（1/2/3）、幾分飽（節(jié)食/七分飽/飽腹/過飽）、運(yùn)動頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）和運(yùn)動時間（半小時/1小時左右/超過1小時）。

1.3 純音聽閾測試

測試前首先對研究對象進(jìn)行外耳道清潔，休息片刻后進(jìn)入指定符合規(guī)定的房間[≤40dB(A)]內(nèi)由專業(yè)人員進(jìn)行聽力測試。使用純音聽力計(jì)（Orbiter 922,Madsen）并遵循《聲學(xué) 測聽方法》（GB/T 16296.1-2018）規(guī)定對研究對象使用上升法進(jìn)行聽力測試。從受試者自述聽力較好耳開始分別測量左右兩耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的純音氣導(dǎo)聽閾，讀數(shù)精確到1dB HL。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年的推薦標(biāo)準(zhǔn)，以聽力較好耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的純音聽閾平均值作為聽力水平的判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）≤25dB HL為聽力水平正常；（2）＞25dB HL為患有ARHI。

1.4 基因分型

依據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫和1000 Genomes選擇候選基因的啟動子、5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）、內(nèi)含子和3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）等的功能性 SNP 位點(diǎn)，須滿足在CHB人群中MAF＞0.05。最終，納入NR3C1基因的9個SNP，分別是rs6191、rs61757411、rs41400245、rs258751、rs6196、rs41423247、rs6877893、rs12655166和rs33388。

根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息并采用AssayDesigner 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物，并交由青島歐易生物科技有限公司合成。NR3C1基因SNP位點(diǎn)的合成引物序列詳見表1。

采集受試者4ml外周靜脈血置于裝有EDTA抗凝劑的試管中，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂贸善坊疍NA提取試劑盒（BioTeKe Corporation）提取血樣中的DNA。然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出含有待檢SNP位點(diǎn)的目的片段，然后用SAP酶去除PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入單堿基延伸引物，這樣探針在SNP位點(diǎn)處僅延伸一個堿基。用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測延伸產(chǎn)物與未延伸引物間的分子量差異,確定該點(diǎn)處堿基。

表1 NR3C1基因SNP位點(diǎn)的合成引物序列Table 1 The synthetic primer sequence of SNP locus of NR3C1 gene

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料間比較使用χ2檢驗(yàn)。單因素和多因素Logistic回歸探討NR3C1基因與ARHI的關(guān)系。我們也同時進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)驗(yàn)證樣本的群體代表性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征比較

本次調(diào)查共納入研究對象共866人。其中男性347人（40.07%），女性519人（59.93%）。年齡為60-88歲。所有的SNP位點(diǎn)的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，說明樣本具有群體代表性。

2.2 ARHI組與聽力正常組間基因型分布情況比較

所有的SNP位點(diǎn)基因型分布在ARHI組和聽力正常組間均不存在顯著差異（P＞0.05），如表2所示。

2.3 ARHI組與聽力正常組間等位基因分布情況比較

rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI組和聽力正常組間存在顯著差異（P＜0.01），如表3所示。

表2 ARHI組與聽力正常組NR3C1基因型分布比較Table 2 Genotype distribution of NR3C1 was compared between ARHI group and normal hearing group

表3 ARHI組與聽力正常組NR3C1等位基因分布比較Table 3 The distribution of NR3C1 allele was compared between ARHI group and normal hearing group

2.4 NR3C1基因單個SNP位點(diǎn)與ARHI的關(guān)系

對NR3C1基因9個SNP位點(diǎn)的共顯性、加性、顯性、隱性和超顯性五種遺傳模型分析，在ARHI組和聽力正常組的基因型頻率及與ARHI的相關(guān)結(jié)果見表4。在未調(diào)整任何協(xié)變量情況下的單因素Logistic回歸顯示，對NR3C1基因9個SNP位點(diǎn)的共顯性、加性、顯性、隱性和超顯性五種遺傳模型分析，所有的SNP位點(diǎn)與ARHI之間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

調(diào)整協(xié)變量基礎(chǔ)上的多因素Logistic回歸分析顯示，rs6877893位點(diǎn)的加性模型（GG vs AG vs AA）下該位點(diǎn)與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.733，95%CI：0.543-0.989，P=0.042）。

調(diào)整協(xié)變量基礎(chǔ)上的多因素Logistic回歸分析顯示，rs33388共顯性模型（TT vs AT）先與攜帶TT基因型的個體相比，攜帶AT基因型的個體患有 ARHI的危險性將會降低（OR=0.672，95%CI：0.453-0.996，P=0.048）；加性模型（AA vs AT vs TT）提示該位點(diǎn)與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.723，95%CI：0.536-0.974，P=0.033）；顯性模型提示相對于攜帶TT基因型的個體，攜帶（AT+AA）基因型的個體患有ARHI的危險性將會降低（OR=0.660，95%CI：0.454-0.960，P=0.030）。最后根據(jù)AIC選擇了共顯性模型為rs33388位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模型。

表4 NR3C1基因SNP位點(diǎn)與ARHI的關(guān)系Table 4 The relationship between SNP locus of NR3C1 and ARHI

C G 2 0 2 6 9 0.7 4 7（0.5 0 5-1.1 0 7） 0.1 4 6 C C 2 6 9 0.7 6 9（0.3 1 6-1.8 6 9） 0.5 6 2 A d d i t i v e C Cv s C Gv s G G 0.8 0 1（0.5 8 5-1.0 9 7） 0.1 6 7 7 5 5.4 4 5 D o m i n a n t G G 4 2 8 1 2 3 1.0（R e f.） 7 5 5.1 1 5 C G+C C 2 2 8 7 8 0.7 5 0（0.5 1 4-1.0 9 4） 0.1 3 5 R e c e s s i v e G G+C G 6 3 0 1 9 2 1.0（R e f.） 7 5 7.2 0 9 C C 2 6 9 0.8 5 0（0.3 5 4-2.0 4 4） 0.7 1 7 S u p e r d o m i n a n c e G G+C C 4 5 4 1 3 2 1.0（R e f.） 7 5 5.4 3 9 C G 2 0 2 6 9 0.7 6 1（0.5 1 6-1.1 2 1） 0.1 6 7 r s 6 8 7 7 8 9 3 C o d o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 6.7 0 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 1 5（0.4 8 4-1.0 5 6） 0.0 9 2 G G 3 1 1 3 0.5 6 4（0.2 5 8-1.2 3 2） 0.1 5 1 A d d i t i v e G Gv s A Gv s A A 0.7 3 3（0.5 4 3-0.9 8 9） 0.0 4 2 7 5 6.7 4 0 D o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 7.0 3 A G+G G 2 4 9 8 7 0.6 9 1（0.4 7 6-1.0 0 2） 0.0 5 1 R e c e s s i v e A A+A G 6 2 6 1 8 9 1.0（R e f.） 7 5 9.5 2 5 G G 3 1 1 3 0.6 3 5（0.2 9 4-1.3 6 8） 0.2 4 6 S u p e r d o m i n a n c e A A+G G 4 3 9 1 2 8 1.0（R e f.） 7 5 8.6 8 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 5 0（0.5 1 2-1.1 0 1） 0.1 4 2 r s 1 2 6 5 5 1 6 6 C o d o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 3 6 C T 1 4 7 4 2 1.2 5 6（0.8 0 2-1.9 6 8） 0.3 1 9 C C 9 2 1.5 0 5（0.2 7 3-8.2 9 7） 0.6 3 9 A d d i t i v e C Cv s C Tv s T T 1.2 5 0（0.8 3 4-1.8 7 5） 0.2 8 0 7 5 8.9 3 9 D o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 7 9 C T+C C 1 5 6 4 4 1.2 6 9（0.8 1 9-1.9 6 8） 0.2 8 7 R e c e s s i v e T T+C T 6 4 8 1 9 9 1.0（R e f.） 7 5 9.9 4 6 C C 9 2 1.4 4 2（0.2 6 2-1.9 2 9） 0.6 7 4 S u p e r d o m i n a n c e T T+C C 5 1 0 1 5 9 1.0（R e f.） 7 5 9.1 6 9 C T 1 4 7 4 2 1.2 4 9（0.7 9 8-1.9 5 6） 0.3 3 0 r s 3 3 3 8 8 C o d o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.1 7 1 A T 2 1 3 7 5 0.6 7 2（0.4 5 3-0.9 9 6） 0.0 4 8 A A 3 4 1 3 0.5 9 9（0.2 7 7-1.2 9 7） 0.1 9 4 A d d i t i v e A Av s A Tv s T T 0.7 2 3（0.5 3 6-0.9 7 4） 0.0 3 3 7 5 7.4 8 4 D o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.2 4 9 A T+A A 2 4 7 8 8 0.6 6 0（0.4 5 4-0.9 6 0） 0.0 3 0 R e c e s s i v e T T+A T 6 2 4 1 8 9 1.0（R e f.） 7 6 1.0 7 8 A A 3 4 1 3 0.6 8 9（0.3 2 3-1.4 7 1） 0.3 3 6 S u p e r d o m i n a n c e T T+A A 4 4 5 1 2 7 1.0（R e f.） 7 5 8.7 9 5 A T 2 1 3 7 5 0.7 0 3（0.4 7 8-1.0 3 4） 0.0 7 4

3 討論

人體隨著年齡的逐漸增加會出現(xiàn)各種老化的現(xiàn)象，比如皮膚組織表現(xiàn)為色斑以及皺紋增加，而ARHI發(fā)生正是因?yàn)槁犛X系統(tǒng)逐漸衰老所導(dǎo)致的[2]。雖然人體都會經(jīng)歷逐漸衰老的過程，但是ARHI的發(fā)生時間、嚴(yán)重程度、進(jìn)展速度卻存在明顯的個體差異。并且研究顯示ARHI發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)，所以研究ARHI的遺傳背景具有重要意義[7,9]。

本研究顯示 rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI組和聽力正常組間存在顯著性差異。在控制環(huán)境因素的多因素Logistic回歸分析顯示，rs6877893位點(diǎn)的加性模型與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs33388共顯性模型、加性模型、顯性模型與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NR3C1基因多態(tài)性與ARHI存在關(guān)聯(lián)。目前對于NR3C1基因與ARHI之間的相關(guān)研究較少，一項(xiàng)非綜合征型耳聾研究從人或老鼠的耳蝸中分離到特異表達(dá)的耳聾候選基因中包含NR3C1基因[14]。有研究利用基因表達(dá)譜芯片在人群中對糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)基因進(jìn)行檢測顯示糖皮質(zhì)激素受體在ARHI組與對照組間基因表達(dá)存在不同，提示糖皮質(zhì)激素受體與ARHI存在相關(guān)[15]。其它對NR3C1基因研究顯示rs41423247位點(diǎn)與心血管疾病危險因素、腹型肥胖、高血壓、糖尿病存在相關(guān)性，這些因素均為目前研究揭示的ARHI危險因素，所以NR3C1基因多態(tài)性可能會引起內(nèi)耳循環(huán)改變的相關(guān)疾病從而導(dǎo)致ARHI的發(fā)生[16-18]。

NR3C1基因位于人體5號染色體上，由9個外顯子構(gòu)成，其編碼的糖皮質(zhì)激素受體（GR）屬于核激素受體超家族，并且研究表明GR在內(nèi)耳分布[13]。下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）分泌的GC對聽力的保護(hù)作用需要GR的參與[19]。動物實(shí)驗(yàn)表明，患有ARHI小鼠內(nèi)耳存在毛細(xì)胞凋亡和聽神經(jīng)退行性改變[20]。GR介導(dǎo)的聽力保護(hù)可能與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。抑制凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)Fas或Bcl-2蛋白家族中促凋亡成員的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成員的表達(dá)均可發(fā)揮抗凋亡作用[11]。例如，地塞米松可能通過基因組作用上調(diào)Bcl-2和Bcl-x1來抵抗TNF-α的耳毒性作用[21]。耳蝸側(cè)壁的血迷路屏障(blood labyrinth barrier,BLB)可以將耳蝸微環(huán)境與血液循環(huán)隔離開來，長期以來人們認(rèn)為內(nèi)耳內(nèi)是不存在免疫反應(yīng)的。然而，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)ARHI患者的耳蝸有炎癥反應(yīng)。在60歲以下存在聽力減退的人群中血清TNF-α和CRP濃度顯著升高[22]。高齡小鼠耳蝸組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ROS的產(chǎn)生以及IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α濃度顯著升高[23]。這都提示炎癥和免疫反應(yīng)是ARHI發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。GC通過GR信號通路具有明顯的抗炎和免疫抑制作用。發(fā)揮主要抗炎作用的GR-α進(jìn)入細(xì)胞核后，與DNA上的GC反應(yīng)元件結(jié)合使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通過抗炎蛋白的表達(dá)影響轉(zhuǎn)錄過程，抑制炎癥反應(yīng)[24]。

本研究首次選取了青島地區(qū)漢族老年人群作為研究對象來探討NR3C1基因多態(tài)性與ARHI之間的關(guān)系，研究顯示NR3C1基因多態(tài)性與ARHI存在關(guān)聯(lián)性，提示今后可以考慮將NR3C1基因作為中老年人聽力篩查的目標(biāo)基因。但是由于ARHI是一個多基因疾病，所以在聽力篩查中不應(yīng)僅將本次研究的NR3C1基因作為目的基因，還應(yīng)該結(jié)合以往的研究把有意義的基因也納入其中作為目的基因，比如：GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等。SNP位點(diǎn)選取時可以考慮選擇研究報道過的有意義的位點(diǎn)對高危人群進(jìn)行篩查，從而提高篩查的質(zhì)量。同時也應(yīng)把噪聲環(huán)境工作者以及受環(huán)境噪聲污染等人群也應(yīng)考慮在內(nèi)。經(jīng)篩查上述基因已呈現(xiàn)多態(tài)性時，應(yīng)考慮調(diào)離工作崗位、佩戴隔音耳塞、早期佩戴助聽器等積極有效措施延緩ARHI發(fā)病進(jìn)程。這為今后開展多中心、大人群、多SNP位點(diǎn)的研究提供了重要參考，并且為ARHI高危人群的篩查和預(yù)防提供了科學(xué)依據(jù)。本研究尚有不足之處，rs61757411、rs41423247、rs6877893、rs33388外其余沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNPs，我們考慮其原因可能是樣本量相對較小，在今后的研究中我們會繼續(xù)增加樣本量并且更深入的研究。