microRNA-873在子宮內膜癌中的表達及對腫瘤細胞增殖和侵襲的影響

黃錦，劉佳淑，劉勝鳳，敬巧，劉玉娟

(川北醫學院附屬醫院婦產科，四川南充 637000)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道中常見的惡性腫瘤之一。早期患者的5年生存率超過90%，而晚期以侵襲性轉移的發生和高復發率為特征，因此晚期子宮內膜癌患者的5年生存率降至20%以下[1-2]。近年來研究表明，微小RNA(microRNA)與腫瘤發生關系密切，可參與腫瘤的發生及發展過程中，故而有望成為腫瘤診斷和治療的新型標志物[3]。miR-873作為一類微小RNA，在食管癌和肝癌中均有不同程度的異常表達[4-5]，但其在子宮內膜癌中作用機制的研究報道少見。因此，本研究旨在探討miR-873在子宮內膜癌組織中的表達及對人子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖和侵襲的影響，從而為子宮內膜癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料

1.1標本來源 收集2016年1月至2020年1月于川北醫學院附屬醫院就診的88例子宮內膜癌患者手術切除的子宮內膜癌組織，患者年齡(49.7±10.0)歲。納入標準[6]：經病理檢查證實為子宮內膜癌；術前未接受化療及放療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者。臨床資料中肌層浸潤深度：≥1/2肌層22例，<1/2肌層66例；伴淋巴結轉移18例，其中累及淋巴管15例；國際婦產科聯盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期22例；組織學類型：Ⅰ型78例，Ⅱ型10例；分化程度：低分化34例，中高分化54例。另收集同期因子宮肌瘤行子宮切除術的60例患者正常子宮內膜組織作為對照組，患者年齡(50.6±9.8)歲。兩組年齡差異無統計學意義(t=0.566，P>0.05)，具有可比性。本研究經川北醫學院附屬醫院醫學倫理學委員會批準(No.2015ER117-1)，患者及家屬知情同意。

1.2細胞系、主要試劑及儀器 人子宮內膜癌細胞系Ishikawa(武漢博士德公司)。DMEM、胎牛血清、DMSO、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，miRNA提取試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒(大連寶生物公司)，MTT試劑(上海東仁化學科技公司)，結晶紫(美國Sigma公司)，Matrigel(美國BD公司)，細胞轉染試劑Lipofectamine 2000(美國Epitomics公司)，miR-873模擬物(miR-873 mimic)及模擬物陰性對照(miR negative control，miR-NC,廣州市銳博公司)。Transwell小室(美國Millipore公司)，ACB-4A1超凈工作臺(新加坡Esco公司)，3110型CO2培養箱(美國Thermo公司)，QuantStudioTM12K Flex實時熒光定量PCR(美國Life technologies公司)，SpectraMax M5酶聯儀(美國Molecular device公司)，IX71正置/倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1細胞分組與轉染 將Ishikawa細胞加入至含10%胎牛血清的DMEM中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。于轉染前1 d接種于6孔細胞培養板，待細胞融合度達30%～50%時，利用Lipofectamine 2000將miR-873 mimic和陰性對照(miR-NC)瞬時轉染至子宮內膜癌Ishikawa細胞，并分為空白對照組、陰性對照組和miR-873過表達組。其中,空白對照組：細胞不做處理，正常培養;陰性對照組：按照Lipofectamine 2000說明書將miR-NC轉染至Ishikawa細胞，轉染終濃度為50 nmol/L，每孔轉染2 mL；miR-873過表達組：按照Lipofectamine 2000說明書將miR-873 mimic轉染至Ishikawa細胞，轉染終濃度為50 nmol/L，每孔轉染2 mL。轉染6 h后更換為含10%胎牛血清培養基繼續培養24 h并進行后續實驗。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 取大小約為0.5 cm×1.0 cm的子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織，于液氮中進行充分研磨，另取各組轉染后細胞約1×106個，采用miRNA提取試劑盒提取組織及細胞中miRNA，使用SpectraMax M5酶聯儀檢測吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.1的樣本用于后續實驗。取2 μL miRNA，按照miRNA cDNA合成試劑盒說明書操作獲得cDNA，置于-20 ℃保存。根據NCBI中GenBank提供的miR-873(序列號：NC_000009.12)，U6(序列號：NC_000898.1)基因序列，由上海生工公司設計并合成引物。采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒檢測組織及細胞中miR-873的表達水平，引物序列見表1。PCR反應體系共20 μL，包括：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循環參數：95 ℃預變性15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；在60 ℃時采集熒光信號，并用QuantStudioTM12K Flex實時熒光定量PCR自帶軟件進行熔解曲線分析，以U6作為內參照，采用2-△△Ct法計算miR-873的表達水平。

表1 引物序列

1.3.3MTT法檢測細胞的增殖能力 采用12.5 g/L胰蛋白酶將各組細胞消化并接種于96孔細胞培養板中(按3 000個/孔的細胞密度接種)，每孔培養液總體積為100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待其貼壁，更換為新的DMEM培養基，每孔加入混有10% MTT檢測試劑的培養液，37 ℃溫育1 h，從培養箱取出96孔細胞培養板室溫平衡后分別于24 h、48 h、72 h和96 h時，采用SpectraMax M5酶聯儀在波長490 nm處檢測各孔吸光度(A490 nm)值，計算平均值，實驗重復3次。

1.3.4Transwell試驗檢測細胞的侵襲能力 取各組轉染后的Ishikawa細胞，用不含血清的DMEM培養基重懸，調節細胞密度為1×106/mL，接種于Transwell小室的上室中，在小室下室加入300 μL含胎牛血清的DMEM，37 ℃溫育24 h。用無菌棉簽輕輕擦拭上室中的上層細胞，擦拭干凈后用0.2%結晶紫染色10 min，棄去染液，PBS清洗5 min，置于光學顯微鏡下觀察并拍照，計數穿膜細胞數，實驗重復3次。

2 結果

2.1子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中miR-873的表達水平 與正常子宮內膜組織(1.07±0.04)比較，子宮內膜癌組織中miR-873的表達水平(0.52±0.12)明顯降低，差異具有統計學意義(t=34.199，P<0.05)。

2.2miR-873表達與子宮內膜癌患者臨床病理參數的關系 子宮內膜癌患者癌組織中miR-873的表達水平與肌層浸潤深度、淋巴結轉移和FIGO分期有關(t分別為11.557、9.626、7.923，P均<0.05)；而與年齡、分化程度、組織類型無關(t分別為0.407、0.381、0.536，P均>0.05)，見表2。

表2 miR-873表達與子宮內膜癌患者臨床病理參數的關系

2.3qRT-PCR檢測各組細胞miR-873的表達水平 與空白對照組(0.51±0.02)和陰性對照組(0.51±0.01)比較，miR-873過表達組中miR-873的表達水平(1.38±0.02)明顯升高，差異具有統計學意義(F=5 855.962，P<0.05)，提示轉染成功；進一步行組間兩兩比較結果顯示，miR-873過表達組miR-873的表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異具有統計學意義(t分別為93.985、93.448，P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組之間比較差異無統計學意義(t=0.537，P>0.05)。

2.4MTT法檢測各組Ishikawa細胞的增殖能力 與空白對照組和陰性對照組比較，轉染24 h后miR-873過表達組細胞增殖受到抑制，差異具有統計學意義(P均<0.05)；進一步行組間兩兩比較結果顯示，miR-873過表達組在24 h、48 h、72 h和96 h時的細胞增殖水平顯著低于空白對照組(t分別為5.908、15.995、19.913、30.242，P均<0.05)和陰性對照組(t分別為5.514、14.715、19.048、28.542，P均<0.05)，差異具有統計學意義；而陰性對照組和空白對照組各時間點之間比較差異無統計學意義(t分別為0.394、1.280、0.866、1.699，P均>0.05)。見圖1。

注：與空白對照組比，*，P<0.05；與陰性對照組比，#，P<0.05。

2.5Transwell試驗檢測各組細胞的侵襲能力 各組細胞于轉染24 h后行Transwell試驗，結果表明，與陰性對照組和空白對照組比較，miR-873過表達組細胞穿膜數顯著降低，差異具有統計學意義(F=36.553，P<0.05)；進一步行組間兩兩比較結果顯示，miR-873過表達組細胞穿膜數顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統計學意義(t分別為7.571、7.227，P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組之間比較差異無統計學意義(t=0.344，P>0.05)。見圖2。

注：A，陰性對照組；B，空白對照組；C，miR-873過表達組。

3 討論

研究表明，結腸癌[7]、肝細胞癌[8]、非小細胞肺癌[9]等惡性腫瘤中miR-873的表達均降低，提示其在腫瘤發生和發展中起著至關重要的作用。Lin等[10]研究發現，miR-873在原發性胃癌組織中下調，在胃癌進展過程中起到腫瘤抑制作用。本研究結果表明，子宮內膜癌組織中miR-873的表達水平與正常子宮內膜組織相比顯著降低，提示miR-873可能在子宮內膜癌進展過程中發揮抑癌基因的功能。進一步對miR-873的表達水平與子宮內膜癌患者臨床病理參數進行分析，結果發現miR-873低表達與肌層浸潤深度、淋巴結轉移和國際婦產聯合會FIGO分期有關。肌層浸潤深度≥1/2肌層、伴淋巴結轉移以及FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期的子宮內膜癌患者組織中miR-873的表達水平顯著低于肌層浸潤深度<1/2肌層、無淋巴結轉移以及Ⅰ～Ⅱ期的子宮內膜癌患者組織，提示miR-873低表達可能促進子宮內膜癌患者病情的進展。

miRNA廣泛存在于真核生物中，在細胞分化、細胞周期、遷移等生理和病理過程中發揮著關鍵作用[11]。Wang等[12]研究發現，miR-873-5p在甲狀腺癌組織和細胞系中表達下調，過表達miR-873-5p可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Liang等[13]研究表明，miR-873在宮頸癌組織中呈低表達；miR-873的上調明顯抑制了人宮頸癌C33a細胞的增殖、侵襲和遷移，但在SiHa細胞中下調的miR-873呈現相反的結果。為探討miR-873對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲的影響，本研究采用Lipofectamine 2000將miR-873 mimc瞬時轉染至子宮內膜癌Ishikawa細胞，結果顯示miR-873過表達組miR-873表達水平明顯增加，提示轉染成功。筆者進一步通過增殖與侵襲試驗檢測Ishikawa細胞增殖和侵襲能力，結果顯示miR-873過表達組細胞增殖和侵襲能力明顯減弱，提示過表達miR-873能明顯抑制Ishikawa細胞增殖和侵襲能力。

綜上所述，miR-873在人子宮內膜癌組織中呈低表達，通過上調miR-873表達可抑制Ishikawa細胞增殖和侵襲的能力，初步明確miR-873在子宮內膜癌中發揮抑癌基因的作用。但本研究仍存在以下不足之處：(1)本研究中的臨床樣本較少，且未進行預后分析；(2)本研究只是初步明確miR-873在子宮內膜癌中發揮抑癌基因的作用，沒有進行靶基因的預測及相關機制研究；(3)本次實驗只是在體外細胞實驗中進行驗證，沒有進行體內動物實驗，后續應進行體內動物實驗進行驗證，進一步完善miR-873對子宮內膜癌發生、發展的作用機制。