應用高通量測序技術檢測甲狀腺乳頭狀癌相關基因變異

楊德仁,王卓,馬蓉

(江蘇省腫瘤醫院﹠江蘇省腫瘤防治研究所﹠南京醫科大學附屬腫瘤醫院 a.檢驗科，b.臨床腫瘤實驗中心，南京 210009)

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤，近年來發病率不斷升高[1-2]。其最常見的病理類型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)，約占所有甲狀腺癌的85%～90%[3-4]。臨床上通常采用Sanger測序技術、免疫組化技術及實時熒光定量PCR技術等對PTC相關單個基因，尤其是BRAFp.V600E基因位點進行檢測，為輔助鑒別診斷、預后和治療提供依據[5-6]。近年來，與甲狀腺惡性腫瘤的鑒別診斷、預后與治療密切相關的新的分子標志物不斷涌現[7]。高通量測序技術(next generation sequencing，NGS)作為新一代測序技術，可同時檢測多個基因的多種變異類型，并可進行定量分析[8]。

本研究采用NGS技術及包含BRAF、HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1、AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等15個目標基因主要內含子和外顯子的引物池對PTC患者進行基因檢測并分析其結果。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年1月至2020年6月于南京醫科大學附屬腫瘤醫院頭頸科收治且術后經病理診斷為PTC患者的石蠟包埋樣本188例。其中男性66例，女性122例，年齡20～75歲，中位年齡46 歲。納入標準：(1)病理組織學明確診斷為PTC；(2)未合并其他腫瘤；(3)分期明確且病例資料完整。按照美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第八版[9]分為Ⅰ期151例，Ⅱ期27例，Ⅲ期3例，Ⅳ期7例。本研究經南京醫科大學醫學倫理委員會批準(南醫大倫審2020148號)，所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Nanodrop2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)， Huber Minichiller 300基因打斷儀(德國Huber公司)，Biometra TONE PCR擴增儀(德國Biometra公司)，Novaseq 6000 基因測序儀(美國Illumina公司)。核酸提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，德國凱杰公司)，捕獲磁珠(美國Beckman Coulter公司)。

1.3DNA 提取 按照核酸提取試劑盒說明書操作提取188例石蠟包埋樣本的DNA。采用Nanodrop2000分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的片段化程度。取吸光度(A260/280 nm)值在1.7～1.9之間，DNA濃度大于10 ng/μL的樣本，置于-20 ℃保存。

1.4NGS文庫構建 提取的DNA首先通過Huber Minichiller 300基因打斷儀進行打斷。然后進行末端修復，磷酸化和添加“adaptor”接頭。采用PCR技術擴增已添加“adaptor”接頭的DNA。利用捕獲磁珠純化擴增產物，使用捕獲探針進行雜交，利用磁珠進行篩選。再次對產物進行PCR擴增，并添加單端“index”標簽。文庫混合，利用Novaseq 6000 基因測序儀進行測序。

1.5生物信息學分析 通過BWA Aligner 0.7.10軟件將測序原始數據與人類基因組(hg19)進行比對。利用GATK 4.0.2.0和VarScan.v2.3.9軟件分析基因突變數據。利用Factera 1.4.4軟件分析基因融合數據。目標區域平均測序深度≥500×，目標區域覆蓋率≥99%，目標區域測序深度均一性≥90%。基因突變頻率大于1%的樣品視為陽性突變。

2 結果

2.1基因突變在PTC患者中的分布情況 共計80.32%(151/188)的標本檢出突變，19.68%(37/188)的標本未檢出突變。此外，74.47%(140/188)的標本檢出1個點突變或基因融合突變，5.32%(10/188)的標本同時檢出2個點突變，其中BRAF和TERT基因雙突變 6例，BRAF和CTNNB1基因、GNAS基因、TP53基因、PIK3CA基因雙突變各1例。0.53%(1/188)的標本同時檢出TERT、NRAS和TP53基因3個點突變。151例突變標本中共計檢出點突變及基因融合突變163個，其中BRAF基因突變率最高(表1)。BRAF基因突變均為典型的p.V600E位點突變。TERT基因突變以啟動子區C228T位點突變為主。RET基因融合突變以CCDC6-RET基因融合突變為主。基因融合突變均為獨立出現。

表1 高通量測序法檢測PTC患者基因突變種類匯總

2.2基因突變豐度比較 結果表明，基因點突變等位基因突變豐度范圍為1.10%～48.04%。基因融合突變讀長(reads)比例范圍為2.30%～55.52%。在雙突變的標本中，2個不同突變等位基因突變豐度基本一致。此外，在TERT、NRAS和TP533個基因同時發生突變的標本中，TERT和NRAS基因等位基因突變豐度基本一致(分別為33.62%和39.67%)，而TP53基因等位基因突變豐度僅為4.13%。

2.3PTC患者基因突變與臨床病理參數間的關系 Pearsonχ2檢驗結果表明，PTC患者基因突變與性別(χ2=0.585，P>0.05)、年齡(χ2=0.575，P>0.05)及臨床分期(χ2=0.711，P>0.05)均無相關性。見表2。

表2 PTC患者基因突變與臨床病理參數間的關系

3 討論

以NGS技術為基礎的基因檢測在PTC患者中的應用已見報道。通過對PTC患者基因突變進行高通量分析，可為全面了解PTC相關腫瘤生物學特性提供技術支持。近年來研究表明，除BRAF基因外,HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1,AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等基因也被臨床上用于甲狀腺惡性腫瘤的鑒別診斷，并證實與患者預后及治療密切相關[7,10-18]。故而本研究選擇了上述15個目標基因進行NGS檢測，分析其在PTC患者中的變異情況。

本研究結果證實，TSHR、AKT1、PETN、KRAS和PAX8基因未檢出突變，這與一些國內外的研究報道的結果不一致[7,10,19]。Ke等[19]研究指出，甲狀腺腫瘤患者基因突變類型包括點突變、插入/缺失突變、基因融合突變等多種類型，并進一步證實插入/缺失突變存在于甲狀腺髓樣癌中，插入/缺失突變可能是甲狀腺髓樣癌特有的突變類型，卻不存在于乳頭狀癌中。而本研究僅發現點突變和基因融合突變兩種類型。

趙競等[7]研究指出，BRAF基因p.V600E位點突變發生于36%～83%的病例中，且通常是獨立出現，不與RET/PTC重組或RAS突變同時存在。BRAF基因p.V600E位點突變為本研究中最主要的突變類型，并證實其不與RET/PTC重組或RAS突變同時存在。但本研究發現14例標本發生了含有BRAF基因p.V600E位點突變的雙突變事件，具體原因尚需進一步分析。TP53基因作為重要的抑癌基因，通常認為僅發生在未分化的甲狀腺癌中，但近期研究[7]表明，乳頭狀癌和濾泡狀癌中也存在TP53基因突變，且通常預后很差。本研究中也檢測出1例PTC患者存在TP53基因突變，進一步證實了TP53基因并不局限存在于未分化的甲狀腺癌中。

本研究發現的雙突變的標本中，2個不同突變等位基因突變豐度基本一致，這表明突變均來源于相同的細胞克隆群。但在1例3個基因同時發生突變的標本中，TP53基因的等位基因突變豐度顯著低于其他2個基因，推測原因可能是TP53基因突變是此腫瘤克隆進展的晚期事件。

本研究也存在以下不足之處：(1)樣本量偏少且來源單一，本研究188例標本均為手術后癌組織石蠟包埋標本，并未涉及細針穿刺活檢及空芯針穿刺活檢標本；(2)本研究僅檢測DNA突變及RNA融合突變，并未將非編碼單鏈RNA分子(miRNA)和長鏈非編碼RNA(LncRNA)等腫瘤領域熱門的分子標志物納入研究范圍。下一步的研究將加大樣本量及樣本類型，并擴大檢測研究的范圍。

綜上所述，利用NGS技術檢測具有通量高、經濟、效率高和可定量檢測的優勢，對甲狀腺腫瘤15個相關基因突變位點進行檢測，可進一步全面理解PTC相關腫瘤生物學特性，為患者的診斷、預后和個體化治療提供依據。