PRRT2 c.649C>T突變導致智力障礙以及蛋白質表達異常 *

馮浩洋，胡平，喬鳳昌，王艷，許爭峰

(南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院&南京市婦幼保健院產前診斷中心，南京210004)

自從2011年在人類中發(fā)現(xiàn)富含脯氨酸的跨膜蛋白2 基因(PRRT2)(染色體16p11.2)的第1個突變以來，該基因突變被認為與多種神經系統(tǒng)疾病有關，如陣發(fā)性運動性運動障礙(OMIM#128200)、良性家族性嬰兒癲癇(OMIM #605751)等[1]。此外，由于該基因突變與運動系統(tǒng)癥狀密切相關，但智力障礙癥狀往往難以被聯(lián)系在一起，運動障礙同時伴有智力障礙的病例報道極為罕見，因此可能導致一些存在智力發(fā)育缺陷但運動系統(tǒng)癥狀輕微的PRRT2突變患者漏診。近年來，外顯子測序技術的推廣使診斷單基因變異所致的遺傳病更為便捷、準確[2]。本研究利用外顯子測序技術診斷1例智力發(fā)育障礙患者，該患者PRRT2基因存在c.649C>T雜合無義突變，并且在體外實驗證實該突變會導致編碼的PRRT2蛋白不能正常表達。報道如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 患者，漢族，男性，14歲，江蘇鹽城人。于2017年7月因認知障礙就診于南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院遺傳中心，進行遺傳咨詢和進一步評估。患者為足月順產，出生5個月后首次病發(fā)癲癇，程度較輕。2004年2月于鹽城市中醫(yī)院檢查腦CT和腦電圖，均提示正常，后服用中藥調理。2006年6月于江蘇省人民醫(yī)院診斷為自閉癥。后患者偶有癲癇發(fā)作，一般由突然站立引起，常僅持續(xù)數秒，并伴有輕微運動障礙。于我院就診時，患者面色呆滯，站立姿勢不穩(wěn)，雙手彎曲不自然，反應遲緩，有輕微言語溝通障礙，情緒管理不良。據父母描述，該患兒自理能力較差，缺乏創(chuàng)造性想象力。智商檢測(IQ)為70。本研究通過南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(No.寧婦倫字[2017] KY-081號)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2細胞系、主要儀器及試劑 HEK 293T細胞購自ATCC細胞庫。S220型Covaris超聲波破碎機(美國Covaris公司)，Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司)，Qubit3.0熒光儀(美國Thermo公司)，Agilent 2100生物分析儀(美國Agilent公司)，Hiseq2500測序儀(美國Illumina公司)，Tanon 5200化學發(fā)光成像儀(上海天能公司)。DNA提取試劑盒(天根生物公司)，文庫構建試劑盒(上海德儀東方公司)，Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6試劑盒(美國Agilent公司)，PCR擴增試劑盒(南京諾唯贊公司)，PrimeSTAR?HS DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，無連接克隆試劑盒(南京ABM公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，RIPA裂解液(上海碧云天公司)，Loading緩沖液(上海天能公司), 蛋白酶抑制劑(瑞士Roche公司)，兔抗鼠Prrt2多克隆抗體(美國Sigma公司)，兔抗鼠FLAG多克隆抗體(美國CST公司)；羊抗兔IgG(H+L)-HRP二抗(南京巴傲得公司)。

1.3外顯子測序 分別抽取患者及父母入院時的外周血5 mL，使用EDTA-K2抗凝。提取先證者及父母外周血中基因組DNA并進行遺傳分析，所有DNA濃度>50 ng/μL，總量>1.5 μg。通過超聲波從剪切的樣品中創(chuàng)建片段文庫，并按照Agilent SureSelect QXT All Human Exon V6試劑盒說明書進行靶向富集。捕獲的DNA被擴增，行固相橋擴增，并在HiSeq2500測序儀上進行雙端測序。使用基因組分析工具包3.4(GATK, www.broad institute.org/gatk)進行與對人類參考序列(hg19)的讀取和變體檢測比對。最后用PCR和Sanger測序驗證突變。針對點突變所在的Exon2的擴增引物由Primer-BLAST在線軟件設計，由蘇州金唯智公司合成(正向引物：5′-TGCCGCTGTCTCTGCTATTC-3′和反向引物：5′-TAAGCGAAGGCCACGATGTT-3′)。PCR產物送蘇州金唯智公司進行一代測序驗證。

1.4構建質粒 為更容易構建質粒，選用小鼠的基因序列。從本課題組前期研究的成年小鼠腦中提取總RNA，反轉錄出第一鏈cDNA[3]。以cDNA為模板使用PrimeSTAR擴增全長小鼠Prrt2編碼序列(正向引物：5′-ATGGCAGCCAGCAGCTCT-3′和反向引物：5′-TTACTTATACACGCCTAA-3′，設計及合成公司同1.3)，通過重疊PCR在Prrt2的蛋白質羧基端插入1個FLAG表位以便于后續(xù)的蛋白質檢測，利用無連接克隆試劑盒克隆至pCAGGS-GFP載體構建Prrt2-FLAG質粒。使用野生型Prrt2編碼序列進行定點誘變重疊PCR以獲得Prrt2c.667C>T(p.R223X)序列[對應人PRRT2c.649C>T(p.R217X)](前段序列正向引物：5′-ATGGCAGCCAGCAGCTCT-3′，反向引物：5′-CTGCTGCAGCAGCACTCGGGG-3′；后段序列正向引物：5′-CCCCGAGTGCTGCAGCAG-3′，反向引物：5′-TTACTTATACACGCCTAA-3′，設計及合成同上)，利用無連接克隆試劑盒克隆至pCAGGS-GFP載體構建PRRT2mut-FLAG質粒。通過測序整個編碼區(qū)域確認構建的突變質粒。

1.5western blot HEK 293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使用Lipofectamine 2000試劑按說明書分別瞬時轉染野生型及突變Prrt2質粒，轉染6 h后更換為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，細胞在混合蛋白酶抑制劑(1∶100稀釋)的RIPA裂解液中裂解。4 ℃溫育1 h后，將裂解物4 ℃、13 800×g離心10 min。取野生型Prrt2上清液作為對照組，相同劑量和濃度的突變型Prrt2上清液作為實驗組，將上清液與Loading緩沖液(1∶5稀釋)混合煮沸。分別將混合物加載至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上電泳(90 V、20 min，100 V 1 h)。隨后將蛋白質條帶在100 V、200 mA的條件下電轉移至0.22 μm聚乙二醇氟化膜中2 h。室溫條件下置于TBST溶解的50 g/L脫脂奶粉溶液封閉1 h。裁膜后分別加入兔抗鼠Prrt2多克隆抗體(1∶2 000稀釋)以及兔抗鼠FLAG多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃溫育過夜。蛋白質條帶使用TBST洗膜1 h，再加入羊抗兔IgG(H+L)-HRP二抗(1∶20 000稀釋)溫育1 h。在曝光前使用ECL顯影液檢測，用Tanon 5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)捕獲信號，曝光時間由機器自動設定。拍攝后，利用ImageJ軟件計算目的條帶灰度值，并利用GraphPad軟件分析數據及制作柱狀圖。

2 結果

2.1變異檢測及驗證結果 通過軟件分析及數據過濾，將測序的原始數據進行去接頭、去重復，過濾低質量數據，3例患者樣本的數據量、測序深度及覆蓋度見表1。

表1 3例研究對象樣本的測序數據量

進一步采用全外顯子測序檢測發(fā)現(xiàn)，該患者16號染色體p11.2區(qū)域PRRT2基因的第2個外顯子編碼區(qū)檢測到1個雜合的無義突變(Chr16:29825024 C>T;c.649C>T;p.R217X, NM_145239.3)，遺傳自母親。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)原則(2015)[4]對該變異進行評估，其變異分類聯(lián)合標準評分為PVS1+PS1+PM1+PM2+PP4，綜合評定為致病性突變。用Sanger測序對外顯子測序結果進行驗證，結果證實該患者的無義突變c.649C>T來自于母親。見圖1。

注：A,該患者家系圖；B，該患者的臨床特征；C，Sanger測序驗證患者及母親PRRT2基因突變。箭頭表示點突變所在位置及堿基，患者及母親均存在雜合突變。

2.2R217X突變導致PRRT2蛋白被過早降解 野生型及突變質粒轉染HEK293T細胞后，經western blot分析結果顯示，表達突變型Prrt2的細胞無法檢出Prrt2(識別蛋白氨基端)和FLAG(識別蛋白羧基端)信號，Prrt2 R223X不能表達，提示PRRT2 R217X在患者體內不能正常表達。見圖2。

注：A,western blot條帶圖，Prrt2為使用anti-Prrt2抗體溫育，F(xiàn)LAG為使用anti-FLAG抗體溫育，Prrt2-FLAG為野生型蛋白，Prrt2mut-FLAG為R223X突變蛋白；B，western blot條帶的灰度值統(tǒng)計柱狀圖；C，人PRRT2 R217X突變與正常PRRT2蛋白表達異常對比的示意圖。

3 討論

在本研究中，我們通過全外顯子測序技術鑒定了1例智力障礙合并癲癇及運動障礙的男性患者的PRRT2基因存在雜合無義突變(c.649C>T;p.R217X)。PRRT2基因(NM_145239.2)位于16p11.2，含有4個外顯子，編碼340個氨基酸。該基因最常見的突變?yōu)閏.649dupC，與本研究發(fā)現(xiàn)的突變相似，均導致編碼蛋白質在脯氨酸富集區(qū)與跨膜區(qū)之間提前終止翻譯。目前，該基因突變被報道的主要臨床癥狀為癲癇及運動障礙，這與該患者的部分臨床癥狀吻合[5-6]。據文獻報道，該基因翻譯蛋白PRRT2通過參與形成突觸前膜神經遞質，釋放復合物，負向調控神經遞質釋放[7]。因此，突變導致調控機制失調，后膜興奮性異常增高，最終引發(fā)運動障礙以及癲癇。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些PRRT2突變患者表現(xiàn)出非典型癥狀如偏頭痛和智力障礙[8-9]，但原因未明。目前，僅少數病例報道為智力障礙表型[4]。攜帶純合PRRT2截斷突變的患者中有52.4%(11/21)存在智力障礙，而攜帶雜合突變的患者中只有0.6%(8/1 423)存在智力障礙。PRRT2突變的智力障礙患者在嬰幼兒時期往往出現(xiàn)嚴重的癲癇甚至強直性陣攣發(fā)作[10]，可能引起腦組織損傷從而影響智力。然而，本研究中的病例沒有嚴重的癲癇大發(fā)作并且腦CT及腦電圖均無異常，提示該患者的智力障礙與重度癲癇之間可能無必然聯(lián)系。值得注意的是，患者母親也是該雜合突變的攜帶者，但無任何臨床癥狀。曾有報道PRRT2突變家系中存在外顯不全的個體[11]。因此，推測患者母親可能同樣為PRRT2突變不完全外顯。

PRRT2在哺乳動物中高度保守，人和小鼠PRRT2蛋白脯氨酸富集區(qū)至跨膜區(qū)氨基酸序列完全一致，小鼠Prrt2的Arg223氨基酸位點對應人PRRT2基因的Arg217位點。為了進一步研究PRRT2(c.649C>T)的突變致病機制，我們克隆了小鼠Prrt2基因并設計了R223X(c.667C>T)突變模擬人類PRRT2_R217X突變。結果發(fā)現(xiàn)，Prrt2_R223X蛋白不能正常表達，提示PRRT2_R217X突變患者PRRT2蛋白體內異常表達，且低于健康人，這與既往報道的PRRT2R217X附近的截斷突變導致蛋白質過早被降解相一致[12]。本研究局限性在于PRRT2蛋白僅在腦組織中特異表達，人體樣本取材困難，我們僅從體外驗證PRRT2 R217X蛋白質表達異常，暫時無法進行體內實驗驗證缺少PRRT2是否影響智力發(fā)育。隨著科技水平進步，相關終會揭示其更深層的致病機理并以此治療此類患者。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PRRT2基因截斷突變除了會導致癲癇、運動障礙等常見臨床癥狀外，還會引起智力障礙等神經系統(tǒng)發(fā)育異常。檢測PRRT2基因對于一些同時存在智力發(fā)育障礙以及運動系統(tǒng)障礙的患者具有一個預警的作用。外顯子測序技術可以快速、準確地診斷該類患者的遺傳學病因。