COL2A1基因新發突變導致先天性脊柱骨骺發育不良的遺傳分析及產前診斷 *

李素萍，金玉霞，楊靜，唐萍，張衛華，周赤燕，沈華祥

(嘉興學院附屬婦兒醫院&嘉興市婦幼保健院 a.產前診斷中心，b.超聲科，c. 產科，浙江嘉興 314051)

先天性脊柱骨骺發育不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita，SEDC)是一種罕見常染色體顯性遺傳病(MIM：183900)，發病率約為1/100 000，其特征是身材矮小，畸形骨骺和椎體扁平，早發性關節退行性變，有時還會表現為近視或視網膜變性伴視網膜脫離等[1-2]?；颊咄昶诔３霈F進展性脊柱彎曲，最終可能會影響呼吸，此外，還存在其他骨骼體征包括扁平脊椎，髖關節畸形導致股骨內旋和畸形足等[3]。先天性SEDC患者之間的臨床表型和影像學特征差異明顯，通常是由COL2A1基因變異引起。一項研究證實，在663例先證者中發現了COL2A1基因460個突變類型，并證實其與21個明確的遺傳病相關[4]。然而，該基因突變熱點與表型相關性的研究報道目前仍較為少見。本研究報道了1例身高矮小的SEDC患兒，對其進行臨床診斷、家系基因檢測和蛋白質功能預測，發現了COL2A1基因變異位點，為該家系遺傳咨詢及產前診斷提供證據。

1 對象與方法

1.1研究對象 先證者，男，8歲，患兒家屬主訴學步時發現姿勢異常，運動智力正常。身體發育較同齡人遲緩，具體表現為身高增長慢，四肢粗短。3歲時曾就診，當時醫生懷疑為軟骨發育不全，未進行進一步檢測，無家族遺傳病史，父母表型正?！，F因再次妊娠于2019年2月1日就診于嘉興市婦幼保健院產前診斷中心。對先證者及父母進一步體檢顯示，先證者身高101.2 cm，體重17.3 kg，父親身高172 cm，母親身高150 cm。先證者身材勻稱，甲狀腺未觸及，四肢脊柱無明顯異常。根據主訴及表現，對患兒進行體格檢查，采集患兒血液樣本進行生化檢查(血常規、生長激素與甲狀腺功能)和影像學檢查。生化檢查結果提示，先證者磷元素含量偏低，鎂元素含量偏高；血糖、肝功能及甲狀腺功能正常。X線攝影考慮骨骺發育不良可能。故而對患兒行遺傳學基因檢測，并對其父母及胎兒進行了Sanger測序驗證以明確病因。依照《國際遺傳性骨病分類標準(2010年版)》，根據該患兒的臨床特征、影像特點以及分子遺傳學的檢測結果，該患兒診斷為SEDC。本研究經嘉興學院附屬婦兒醫院倫理委員會批準(批準文號：2018010)，患者監護人知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Agilent 2100 Bioanalyzer (美國安捷倫科技公司)，MGISEQ-2000高通量測序儀(深圳華大基因生物醫學工程公司)，ABI 3730XL測序儀(美國賽默飛世爾科技公司)。MagPure Buffy Coat DNA Midi KF Kit(廣州美基生物科技公司)，Segmentase隨機打斷酶(深圳華大基因生物醫學工程公司)，基因片段捕獲探針(美國Roche NimbleGen公司)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 采用EDTA-K2抗凝管抽取先證者及其父母外周血各2 mL,另抽取胎兒羊水10 mL，按照MagPure Buffy Coat DNA Midi KF Kit說明書提取DNA,提取樣本的質控標準：DNA濃度≥20 ng/μL，總量≥1 000 ng。提取后將樣本置于-20 ℃保存。

1.3.2高通量測序 采用華大基因研究院定制的合成芯片，應用目標捕獲高通量測序法，對454個基因可能導致的497種與遺傳性骨病相關的單基因疾病進行基因檢測。步驟：將制備好的DNA片段進行末端補平，接頭連接，經Non-Captured PCR構建完整的文庫。通過檢測芯片上帶有生物素的單鏈DNA探針進行雜交，利用鏈霉親和素標記的磁珠將選取的特定基因的外顯子(Exon)及側翼±30 bp區域進行富集，經PCR擴增富集后產物，對PCR產物進行qPCR檢測獲得序列捕獲雜交效率。文庫質控標準為子文庫濃度≥40 ng/μL，總量≥1 000 ng，子文庫片段大小300～550 bp。質控標準：10 ng/μL≤洗脫濃度≤50 ng/μL，洗脫文庫片段大小300～550 bp。qPCR檢測質控合格后，將一定數量的文庫制備DNA納米球(DNB)后進行上機測序，對數據進行分析質控，信息分析質控標準為去重深度≥100X，30X覆蓋度≥95%，Q20≥90%,Q30≥85%，得到原始測序數據。

1.3.3變異致病性分析 對下機的原始數據進行測序質量評估，去除低質量以及被接頭污染的reads。采用BWA軟件與HG19/HG20進行序列比對，進行序列捕獲效果評價，用GATK軟件進行單核苷酸變異(SNV)和Indel的查詢，生成目標區域堿基多態性結果，進行數據庫(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。對檢測到的變異，基于HGMD、OMIM數據庫、ClinVar數據庫以及各大骨病致病突變數據庫及文獻搜索查閱分析，同時使用 PolyPhen-2(Polymorphism Phenotyping version 2)軟件對錯義變異進行功能預測和致病性分析，參考美國醫學遺傳學和基因組學學院(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)相關指南[5]對變異進行致病性判讀。

1.3.4基因突變驗證 采用Sanger測序法，使用ABI 3730XL測序儀對先證者檢出的變異進行父母和胎兒驗證。

2 結果

2.1生化指標及基因檢測結果 先證者的生化檢測結果見表1。先證者存在COL2A1基因(NM_001844)第50個外顯子的c.3589G>A(p.Gly1197Ser)為雜合變異，先證者父母及胎兒均未發現該位點變異(圖1)。

表1 先證者各生化指標檢查結果

注：A，先證者c.3589G>A(p.Gly1197Ser)位點突變驗證結果；B，與先證者突變位點的同一位置的父親堿基序列；C，與先證者突變位點的同一位置的母親堿基序列；D，與先證者突變位點的同一位置的胎兒堿基序列。

2.2致病性和保守性分析 采用PolyPhen-2及Mutation Taste軟件對COL2A1基因新發變異進行蛋白質功能預測及保守性分析，結果表明，PolyPhen-2軟件預測值為0.994，考慮為致病性變異；氨基酸序列保守性為高度保守(圖2A)。Mutation Taste分析提示該變異為致病變異，該位點氨基酸序列高度保守(圖2B)。因此，COL2A1基因c.3589G>A變異可能是該SEDC患兒的致病原因。

注：A，PolyPhen-2軟件對COL2A1基因c.3589G>A(p.Gly1197Ser)變異預測結果為0.994(分數越接近于1，致病性可能越大)；B，Mutation Taste軟件分析不同物種間氨基酸突變位點保守性。

3 討論

COL2A1基因編碼Ⅱ型前膠原蛋白的α1鏈，該基因的分子缺陷導致Ⅱ型膠原病[6]。Ⅱ型膠原是一種同源三聚體蛋白，三螺旋中的甘氨酸被取代，極大地損害了同源三聚體的組裝和穩定性，在骨成熟和骨重塑中也發揮重要作用[7-8]。這種組織特異性表達導致攜帶COL2A1致病突變的患者具有廣泛表型譜的異質性，出現骨骼發育不良，矮小、眼部異常和聽力問題等臨床特征[9]。根據現有報道，尚未發現COL2A1基因明顯的突變熱點，但大多數的COL2A1突變發生在螺旋重復序列區域內。由于Ⅱ型膠原的三螺旋結構是從羧基端向氨基端方向折疊的，因此，有學者認為位于C端的突變與N端突變相比具有更嚴重的臨床表型[10]。此外，有學者在一項29例COL2A1基因突變患者臨床研究中發現，該基因新突變在中國人群中可導致骨關節炎伴輕度軟骨發育不良和骨骺發育不良多發性近視耳聾[11]。這表明突變的類型、位置和周圍的序列及其他未知的遺傳和表觀遺傳因素均可能影響到表型，該基因突變譜和相關的表型尚需進一步研究。

Terhal等[12]對93例SEDC或相關疾病患者的臨床、影像學和基因型資料進行回顧性分析，結果發現50%以上的患者做過脊柱側彎、股骨截骨術或髖關節置換術；56%的患者齒狀突發育不良；近視率為45%；37%的患者聽力異常。其中，檢出2例患者發生甘氨酸至絲氨酸的替換,導致了相對輕微的表型。然而，在702位出現的同樣蛋白質轉換導致了嚴重的SEDC(p.Gly702Ser)。甘氨酸至絲氨酸的替換可能導致不同的表型，某些甘氨酸至絲氨酸的替換只會產生較溫和的骨骼表型。本研究檢出1 197位甘氨酸至絲氨酸的替換是一種非保守性氨基酸取代，影響了含有Gly-X-Y重復序列的三螺旋區的甘氨酸殘基，經分析提示該變異可能破壞蛋白質的結構進而影響其功能，在人類基因突變數據庫中已經報道了影響G-X-Y基序附近甘氨酸殘基的錯義變異(G1200S, G1200C)與COL2A1相關的疾病有關，臨近位點的突變表明該蛋白質區域的功能非常重要。本例患兒表型相對輕微，表現為腰椎形態不完整，骨骺發育不良。有文獻報道了1例攜帶與本例具有相同位點變異的女孩，其頭部相對于軀干和四肢較短，面部平坦，下頜較小，有后下頜畸形，U型腭裂；四肢和脊椎排列整齊，胸部、髂骨短而寬[13]。結合以上研究報道，COL2A1基因c.3589G>A變異可以解釋患兒骨骼發育不良表型，但該位點目前病例支持證據較少。然而，本研究僅報道1例家系，骨骼異常除受到與遺傳相關的基因調控外，仍可能有其他的綜合因素參與其中，該位點突變與表型相關性需更多的病例支持。綜上所述，本研究證實COL2A1基因新發突變為該患兒的致病原因，為該家系的遺傳咨詢和產前診斷提供了依據。

致謝：感謝上海交通大學附屬新華醫院小兒內分泌科余永國教授對臨床診斷的指導和支持，感謝浙江博圣生物技術股份有限公司的技術支持。