SNRPA對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及Snail1信號通路的影響

李永剛，郭潔，劉延峰，徐長福，牛智平

(1.咸陽市第一人民醫(yī)院普外一科，陜西咸陽 712000；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，西安 710077；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安710061；4.安康市人民醫(yī)院普外科，陜西安康725000)

胃癌是常見的消化道腫瘤疾病之一，手術(shù)是胃癌的最主要治療手段，但患者的預(yù)后及生存率相對不佳[1]。因此，探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，找到胃癌早期診斷的標(biāo)記分子對于改善患者的預(yù)后和治療十分重要[2]。小核核糖核蛋白多肽A(homo sapiens small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A,SNRPA)是一種含有2個RNA結(jié)合區(qū)和282個氨基酸的蛋白質(zhì)，其在剪接體的形成和mRNA的剪接過程發(fā)揮一定的作用。多項研究[3-6]表明，SNRPA在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平明顯升高，但其在胃癌患者腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)研究報道少見。本研究旨在探討SNRPA在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并分析SNRPA調(diào)控鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(Snail1)對人胃癌細(xì)胞系增殖、遷移和侵襲的影響，以期為胃癌患者臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及培養(yǎng)條件 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC27、SGC7901、BGC823和MGC803購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將上述細(xì)胞系置于含10%FBS和青霉素/鏈霉素的改良Eagle培養(yǎng)基(Modified Eagle)中，并置于飽和濕度、37 ℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)，通過反復(fù)傳代培養(yǎng)去除自我更新能力差的細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2研究對象 收集2018年1月至12月于咸陽市第一人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的89例胃癌患者的癌組織和癌旁組織(距腫塊邊緣距離>4 cm，且切緣陰性)，男性55 例，女性34 例，年齡為31～88歲，中位年齡63歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)診斷為原發(fā)性胃癌；(3)術(shù)前均未行放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并胃腸道潰瘍、腸梗阻、出凝血功能障礙以及其他嚴(yán)重全身疾病患者；(2)有家族腫瘤遺傳史；(3)既往有腹部手術(shù)史；(4)患者臨床資料不完整。每例患者采集2份樣本，1份立即置入液氮中保存，另1份經(jīng)4%多聚甲醛固定，4 ℃保存。本研究經(jīng)咸陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號：(2018)倫理(會)第(04001)號]，患者或家屬知情同意。

1.3主要試劑及儀器 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Power SYBR@Green PCR Master Mix均購自日本TaKaRa公司，SNRPA siRNA、Snail1 siRNA、SNRPA過表達(dá)質(zhì)粒、Snail1過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)陰性對照、EDU試劑盒均購自廣州銳博生物科技公司，MEM完全培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Sciencecell公司，CCK-8試劑購自上海碧云天生物公司，兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人SNRPA多克隆抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。NanoDrop 2000微量紫外分光光度計、多功能酶聯(lián)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，紫外透射反射儀(上海滬粵明科學(xué)儀器公司)。

1.4RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實時定量PCR(qRT-PCR) 采用在線數(shù)據(jù)庫Gene Expression Profiling Interactive分析(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)驗證Snail1和SNRPA等基因的差異表達(dá)[6]。按Trizol試劑說明書提取胃癌組織及上述胃癌細(xì)胞系(5×104個)中的總RNA，使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計對RNA進(jìn)行定量，取吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0的樣本，置于-20 ℃保存。取1 mg RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，取1 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物由上海生工公司設(shè)計并合成。SNRPA上游引物序列：5′-CAAACCTATGCGTATCCAGT-3′,下游引物序列：5′-GGATTCTCAGAAAGAGGCTG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物序列：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′；Snail1上游引物序列：5′-AGCCCAAGCAGTAGTACATT-3′，下游引物序列：5′-CATTCACATCCGTCGTTCC-3′。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μmol/L dNTPs 4 μL,10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外透射反射儀掃描并拍照。結(jié)果以2-△△Ct法表示。實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期人胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于飽和濕度、37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。實驗設(shè)為NC組(使用非特異性siRNA進(jìn)行干預(yù))、vector組(使用PBS干預(yù))和si-SNRPA組(使用SNRPA-siRNA進(jìn)行干預(yù))。每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔中加入2 mL 10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，接種5×104個上述各組細(xì)胞于酞片表面和空孔中，搖勻后，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60%時，按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于提取總RNA，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞蛋白質(zhì)用于后續(xù)實驗。

1.6細(xì)胞增殖分析

1.6.1CCK-8細(xì)胞增殖試驗 取轉(zhuǎn)染后人胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種3×103個細(xì)胞，每組設(shè)5個平行孔，分別于1、2、3、4、5 d后，避光條件下加入CCK-8溶液10 μL；于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，采用多功能酶聯(lián)儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6.2EdU細(xì)胞增殖試驗 以4×104個/孔的細(xì)胞密度將胃癌細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基,進(jìn)行轉(zhuǎn)染或共培養(yǎng),于觀察終點2 h時加入 EdU溶液(終濃度為50 μmol/L)，按試劑盒說明書固定細(xì)胞、染色及鋪片。使用倒置熒光顯微鏡，觀察 Appolo567染色使用550 nm激發(fā)光，觀察 Hoechst 3342染色使用350 nm激發(fā)光，放大倍數(shù)為200倍。每孔等分4個象限，每個象限隨機(jī)拍攝3張不同視野照片并計數(shù)，分別計算細(xì)胞核(Hoechst)及增殖細(xì)胞(Appolo)染色細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞增殖率=Appolo/Hoechst×100%，每個復(fù)孔Hoechst染色陽性細(xì)胞計數(shù)大于1 000個。同組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.7Transwell試驗

1.7.1細(xì)胞遷移試驗 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS，用無血清培養(yǎng)基洗滌，在Transwell小室的上室接種5×104個(100 μL)細(xì)胞，下室加入750 μL含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，棉簽拭去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。PBS洗滌3次，鏡下計數(shù)5個不重復(fù)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7.2細(xì)胞侵襲試驗 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS，用無血清培養(yǎng)基洗滌，在Transwell小室的上室接種5×104個(100 μL)細(xì)胞，基質(zhì)膠包被的Transwell小室的下室加入200 μL細(xì)胞懸浮液，同時加入750 μL含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，避免下層培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡；細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄去上清液，用冷的無水甲醇室溫固定10 min，空氣干燥，結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽將上層細(xì)胞擦去，PBS沖洗后于顯微鏡下觀察并拍照，計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8western blot 提取上述胃癌組織和5種胃癌細(xì)胞系中總蛋白質(zhì)，采用BCA方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣并進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜浸入50 g/L脫脂奶粉封閉溫育1 h， 加入兔抗人Snail多克隆抗體(1∶1 000稀釋)及兔抗人多克隆抗體SNRPA(1∶500稀釋)，4 ℃溫育過夜，內(nèi)參照的PVDF膜浸入50 g/L奶粉封閉液中4 ℃過夜；TBST清洗后，室溫溫育二抗1 h，內(nèi)參照的PVDF膜浸入HRP標(biāo)記的GAPDH(1∶5 000稀釋)，室溫溫育1 h；TBST漂洗后，對PVDF膜進(jìn)行顯影，采用化學(xué)發(fā)光成像儀成像，測定目的條帶灰度值，分析蛋白質(zhì)表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參照計算目的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1SNRPA在胃癌患者組織中的表達(dá) qRT-PCR法檢測結(jié)果表明，SNRPA在癌組織中的相對表達(dá)量為(6.23±2.09)，明顯高于癌旁組織(3.91±1.64)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.239，P<0.001)。此外，進(jìn)一步對胃癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SNRPA在胃癌患者中的表達(dá)水平與腫瘤組織的大小、病理分期有關(guān)，見表1。

表1 SNRPA表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的比較(n=89)

2.2SNRPA升高促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖 western blot結(jié)果顯示，SNRPA在AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.47±0.10)，在HGC27細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.32±0.08)，在BGC823細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.29±0.07)，在MGC803細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.30±0.09)，在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.23±0.05)。5種細(xì)胞中，SNRPA在AGS細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于其他4組(t分別為11.050、13.912、11.921和20.251，P均<0.001)，而SNRPA在SGC 7901細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其他4組(t分別為9.000、20.251、6.580、6.414，P均<0.001)，見圖1A。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果證實，SNRPA在SNRPA siRNA組的表達(dá)水平為(0.19±0.07)，顯著低于NC組的(0.38±0.12)和SNRPA組(0.47±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為12.902、23.168，P均<0.001)，提示SNRPA基因干擾和過表達(dá)有效，見圖1B。CCK-8和EdU細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明，SNRPA siRNA組EdU陽性率為(0.37±0.06)%，顯著低于NC組(0.58±0.09)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.316，P<0.001)，SNRPA組EdU陽性率為(0.62±0.07)%，顯著高于vector組(0.29±0.05)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=36.190，P<0.001)，提示SNRPA對胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，見圖1C～1F。

注：A，SNRPA在5種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況；B，SNRPA siRNA和SNRPA過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和有效性檢驗；C～D，CCK-8試驗檢測SNRPA對胃癌細(xì)胞增殖，***，P<0.001；E～F，EdU試驗檢測細(xì)胞增殖結(jié)果。

2.3SNRPA促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移 Transwell細(xì)胞遷移試驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染siSNRPA 48 h后，NC組AGS細(xì)胞遷移率和侵襲率分別為(98.57±25.04)%和(95.21±30.06)%，顯著高于SNRPA siRNA組的(26.75±8.08)%和(24.25±10.32)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為25.751、21.063，P均<0.001)。反之，SGC7901在轉(zhuǎn)染SNRPA 質(zhì)粒48 h后，SNRPA組SGC7901細(xì)胞遷移率和侵襲率分別為(385.54±60.39)%和(320.14±45.58)%，顯著高于vector組的(105.21±28.86)%和(124.43±38.25)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為39.512、31.029，P均<0.001)，見圖2。

注：A、B分別為NC組和SNRPA siRNA組對AGS細(xì)胞遷移率和侵襲率的影響；C、D分別為vector組和SNRPA組對SGC7901細(xì)胞遷移率和侵襲率的影響。

2.4western blot和qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞Snail1的結(jié)果 AGS和SGC7901細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siSNRPA和SNRPA 質(zhì)粒48 h后，在AGS細(xì)胞中，SNRPA siRNA組和vector組Snail1的表達(dá)水平分別為(0.19±0.07)和(0.21±0.09)，顯著低于NC組的(0.36±0.10)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為13.139、10.518，P均<0.001)，見圖3。SGC7901在轉(zhuǎn)染SNRPA 質(zhì)粒48 h后， SNRPA組Snail1mRNA的表達(dá)水平為(8.92±1.13)，顯著高于NC組的(3.76±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=42.943，P<0.001)。

圖3 western blot檢測分別轉(zhuǎn)染siSNRPA和SNRPA 質(zhì)粒48 h后的AGS細(xì)胞

2.5Snail1對胃癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響 CCK8試驗及Transwell細(xì)胞遷移試驗檢測Snail1對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的結(jié)果顯示，在Snail1 siRNA沉默Snail1表達(dá)后，AGS細(xì)胞增殖率和遷移率分別為(34.54±10.31)%和(30.69±9.58)%，顯著低于NC組的(102.64±25.58)%和(100.05±36.74)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為23.295、17.234，P均<0.001)，見圖4A～D。

2.6敲減Snail1可逆轉(zhuǎn)SNRPA對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果顯示，SNRPA 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SNRPA組SGC7901細(xì)胞增殖率為(180.75±34.59)%較vector組的(58.08±20.25)%顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.873，P<0.001)。而與Snail1 siRNA共轉(zhuǎn)染后可以逆轉(zhuǎn)SNRPA過表達(dá)質(zhì)粒對細(xì)胞增殖及遷移能力的促進(jìn)作用(圖5A～C)。

注：A，CCK-8試驗檢測胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS的結(jié)果；B，AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲率，***，P<0.001；C、D，AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲的鏡下結(jié)果。

注：A，敲減Snail1后SGC7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲的結(jié)果；B，敲減Snail1后胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲細(xì)胞數(shù)；C，CCK-8試驗檢測敲減Snail1后不同時點胃癌細(xì)胞的結(jié)果，**，P<0.01，***，P<0.001;NS，無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

以往的研究表明，小核核糖核蛋白復(fù)合物(U1snRNP)參與了許多真核細(xì)胞的重要活動，如前mRNA剪接和凋亡等[7-8]。然而U1snRNP復(fù)合物及其組分在腫瘤發(fā)生過程中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果證實，SNRPA作為U1snRNP復(fù)合物的成員，在胃癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，并且可能與患者的不良預(yù)后相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)SNRPA蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)，且與胃癌患者的腫瘤大小、腫瘤分期及預(yù)后不良密切相關(guān)。筆者進(jìn)一步通過細(xì)胞增殖、侵襲和遷移試驗證實，SNRPA通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到促進(jìn)作用。

本課題組前期試驗通過生物信息學(xué)檢索以及細(xì)胞學(xué)水平驗證，證實Snail1是SNRPA的潛在靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，Snail1是鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail超家族成員，由264個氨基酸組成，通常起轉(zhuǎn)錄抑制作用。受PI3K和WNT信號通路控制的Snail1的磷酸化和核定位是Snail1調(diào)控的關(guān)鍵[9]。Snail1在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其與E-cadherin的丟失以及波形蛋白(vimentin)和纖維連接蛋白(fibronectin)的上調(diào)密切相關(guān)[10]。有學(xué)者通過細(xì)胞學(xué)研究證實，F(xiàn)盒蛋白FBXO31能夠降低Snail1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其加速降解，以此來抑制胃癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程以及胃癌細(xì)胞的惡性表型[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SNRPA蛋白在腫瘤組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。有學(xué)者對SNRPA蛋白在肝癌中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)SNRPA蛋白不僅在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，而且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移過程[13]。實際上SNRPA蛋白在不同腫瘤中的表達(dá)存在差異性，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SNRPA蛋白在消化道腫瘤組織中的表達(dá)水平降低，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)[14]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中SNRPA蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且SNRPA的過表達(dá)明顯促進(jìn)Snail1的表達(dá)水平，而SNRPA的敲除抑制Snail1的表達(dá)水平。筆者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Snail1基因敲除抑制了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，且Snail基因敲除減弱了SNRPA過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，以上結(jié)果提示Snail1很可能是人胃癌細(xì)胞中SNRPA的下游靶點。然而，本研究也存在一定的局限性，例如樣本量相對較小且為單中心的研究，此外，未對患者進(jìn)行長期的隨訪以分析其生存結(jié)果。SNRPA調(diào)控胃癌細(xì)胞Snail1表達(dá)的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實驗證實。

綜上所述，SNRPA是胃癌中一個潛在的癌基因，其在腫瘤組織中的表達(dá)明顯升高，在體外能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。本研究不僅為胃癌的發(fā)生機(jī)制發(fā)現(xiàn)了新的內(nèi)容，同時也為胃癌治療提供了新的潛在靶點。